一種能同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素單克隆抗體的制備及特性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的人畜共患致病菌,廣泛存在于自然界中,其產(chǎn)生的腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SE)可通過污染食物而導(dǎo)致食物中毒。目前,隨著人們對(duì)食品安全重視度的加深,國際上已將腸毒素的檢測(cè)列入食品檢驗(yàn)法規(guī),因此建立靈敏、快速的腸毒素檢測(cè)方法,是食品安全檢測(cè)的一項(xiàng)重要研究內(nèi)容。
　　 腸毒素的檢測(cè)方法主要有動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法

2、、生物傳感器技術(shù)和超抗原技術(shù)。在這些方法中,免疫學(xué)方法因其具有簡便、快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn),是檢測(cè)腸毒素廣泛采用的一項(xiàng)技術(shù)。單克隆抗體(monoclonalanibody,McAb)純度高,特異性強(qiáng),一經(jīng)研制出,便可大批量生產(chǎn),將其用于腸毒素的免疫學(xué)檢測(cè)將大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。商品化腸毒素ELISA檢測(cè)試劑盒中采用的單克隆抗體主要是通過細(xì)胞融合技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單獨(dú)免疫一種抗原所產(chǎn)生的單抗,一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種腸毒素。已知腸毒

3、素種類多達(dá)20種,葡萄球菌食物中毒往往也不是由單一腸毒素引起的,在實(shí)際檢測(cè)過程中,有時(shí)不需要對(duì)腸毒素血清型作出鑒定,只要判斷有沒有腸毒素存在即可,因此如果一次反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)多種腸毒素將大大減少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。為此,采用混合免疫法,篩選制備能同時(shí)針對(duì)多種腸毒素抗原的共同決定簇的單克隆抗體,有可能實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)檢測(cè)多種腸毒素。
　　 本課題以引起葡萄球菌食物中毒比較常見的金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素(staphyloc

4、occal enterotoxin A,SEA和staphylococcal enterotoxin B,SEB)作為免疫原,采用混合免疫方法,運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備得到同時(shí)針對(duì)SEA和SEB的單克隆抗體；同時(shí)以SEA單獨(dú)免疫BALB/c小鼠為對(duì)照,經(jīng)同樣的方法,制備得到相應(yīng)的抗SEA單克隆抗體。對(duì)兩種免疫方法制備的單克隆抗體的性質(zhì)進(jìn)行了一系列的分析和比較,并采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)混合免疫制備的單抗在金黃色葡萄球菌腸毒素污染的乳制品中腸毒

5、素的檢測(cè)進(jìn)行了初步的應(yīng)用評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1抗SEA-SEB多克隆抗體的制備及ELISA分析
　　 采用SEA和SEB兩種抗原等量混合免疫BALB/c小鼠(編號(hào)1～3),免疫劑量為20μg次/只(SEA和SEB各10μg),在每次免疫后的第7 d進(jìn)行采血,得到抗血清。間接ELISA實(shí)驗(yàn)分析表明,免疫小鼠從第21 d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49 d抗體的效價(jià)達(dá)到較高水平,其中2號(hào)小鼠第四次免疫后的抗血清針對(duì)SE

6、A的效價(jià)為4.5×104,針對(duì)SEB的效價(jià)為5.0×104；抗血清對(duì)SEA的靈敏度為81.3 ng/mL,對(duì)SEB的靈敏度為62.4 ng/mL。抗血清對(duì)SEA和SEB都有很強(qiáng)的特異性,與金黃色葡萄球菌C1型腸毒素(SEC1)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)均無交叉反應(yīng)。
　　 同時(shí),采用SEA單獨(dú)免疫BALB/c小鼠(編號(hào)4～6),免疫劑量為10μg/次/只,免疫小鼠從第21 d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49 d抗體

7、的效價(jià)達(dá)到較高水平,其中4號(hào)小鼠第四次免疫后的抗血清針對(duì)SEA的效價(jià)為5.0×104；抗血清對(duì)SEA的靈敏度為73.9 ng/mL。抗血清對(duì)SEA有很強(qiáng)的特異性,與SEB、SEC1、BSA和OVA均無交叉反應(yīng)。
　　 2抗SEA-SEB單克隆抗體的制備及性質(zhì)分析
　　 采用SEA和SEB混合免疫的2號(hào)小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法亞克隆,獲得1株能同時(shí)分泌抗SEA和SEB

8、的雜交瘤細(xì)胞3F2。采用SEA單獨(dú)免疫的4號(hào)小鼠,經(jīng)同樣的方法,獲得1株分泌抗SEA的雜交瘤細(xì)胞3C12。
　　 將2株雜交瘤細(xì)胞分別注射于BALB/c小鼠體內(nèi)生產(chǎn)腹水抗體,用間接ELISA方法對(duì)收集到的抗體的效價(jià)、靈敏度、特異性、親和力、雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目和分泌抗體的穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行了一系列的分析。結(jié)果表明,雜交瘤細(xì)胞3F2所產(chǎn)腹水抗體針對(duì)SEA的效價(jià)為4×105,靈敏度為133.2 ng/mL,親和力常數(shù)為8.18×10

9、7L/mol;針對(duì)SEB的效價(jià)為1×105,靈敏度為82.5 ng/mL,親和力常數(shù)為5.32x107L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無交叉反應(yīng)。雜交瘤細(xì)胞3C12所產(chǎn)腹水抗體針對(duì)SEA的效價(jià)為2×105,靈敏度為115.9 ng/mL,親和力常數(shù)為6.76×107L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無交叉反應(yīng),與SEB僅有很微弱的交叉反應(yīng)。
　　 通過對(duì)兩株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目分析表明,雜交瘤細(xì)胞3F2和3C

10、12的染色體數(shù)都在100條左右,近似等于兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和,說明得到的雜交瘤細(xì)胞是親本細(xì)胞的融合。2株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代6周和三個(gè)月的反復(fù)凍融后,分泌抗體的能力及效價(jià)水平變化不大,表明這兩株雜交瘤細(xì)胞株比較穩(wěn)定。
　　 3抗SEA-SEB單克隆抗體在乳制品檢測(cè)中的初步應(yīng)用
　　 選取易受腸毒素污染的乳制品(牛奶和酸奶)為研究對(duì)象,對(duì)混合免疫制備的單抗3F2在腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。(1)將單一腸毒素SE

11、A或SEB添加到不含腸毒素的牛奶樣品中,分別用單抗3F2、單抗3C12作為檢測(cè)抗體,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)樣品中腸毒素的回收率進(jìn)行了測(cè)定。3F2對(duì)SEA和SEB都有較好的回收率,對(duì)SEA的平均回收率在88.3％～103.5％之間,對(duì)SEB的平均回收率在86.2％～101.6％之間；3C12對(duì)SEA的平均回收率在86.7％～98.1％之間。(2)將三種不同型別的腸毒素(SEA、SEB和SEC1)進(jìn)行組合,分別添加到不含腸毒素的牛奶樣品