骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞的改良誘導(dǎo)法.pdf

1、第一部分：建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)與鑒定的穩(wěn)定體系
　　目的:根據(jù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)的生物學(xué)特性和生長環(huán)境,選取兩種體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法對SD大鼠進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng),分析比較兩種方法獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度、數(shù)量和功能,為本研究建立穩(wěn)定的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件。
　　方法:通過全骨髓培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法,以5周齡SPF級SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動物,體外分離純化rBM

2、SCs,對原代到第五代(P5)細(xì)胞進(jìn)行生長密度的記錄進(jìn)而繪制生長曲線;通過MTT實(shí)驗(yàn)和臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)比較兩種培養(yǎng)方法的效率;通過成骨和成脂誘導(dǎo)來鑒定rBMSCs的分化能力來確定所培養(yǎng)細(xì)胞的分化潛能。
　　結(jié)果:rBMSCs大約5天形成成纖維細(xì)胞樣集落,14天融合至80％-90%,第一代細(xì)胞(P1)至第五代細(xì)胞(P5)生長過程中,每生長約5天即可傳代,細(xì)胞生長曲線呈“S”型,rBMSCs可定向分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞,全骨髓培養(yǎng)法獲

3、得的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P3)生長能力較強(qiáng),誘導(dǎo)效率高。
　　結(jié)論:通過全骨髓培養(yǎng)法體外獲得的rBMSCs生長活力高并且細(xì)胞分化能力強(qiáng),可作為后期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)方案。
　　第二部分：改良誘導(dǎo)法體外誘導(dǎo)rBMSCs分化為雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞
　　目的:通過體外誘導(dǎo)rBMSCs分化成為雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞,比較傳統(tǒng)生殖細(xì)胞誘導(dǎo)法和改良生殖細(xì)胞誘導(dǎo)法的差別,從而優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞

4、的條件。
　　方法:結(jié)合現(xiàn)有的誘導(dǎo)方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),用單純的全反式維甲酸誘導(dǎo)液誘導(dǎo)細(xì)胞3天后換為改良的FSH、LH和T誘導(dǎo)液誘導(dǎo)rBMSCs至7天、14天和21天,選取Stra8、Ddx4(Vasa)等作為不同時(shí)期雄性生殖細(xì)胞的標(biāo)志物進(jìn)行RT-qPCR檢測,分析其mRNA的表達(dá)量差異。通過Westernblot和免疫熒光染色法檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)雄性生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志STRA8和VASA的蛋白水平。
　　結(jié)果:RT-qPCR檢

5、測結(jié)果顯示改良誘導(dǎo)法誘導(dǎo)后的細(xì)胞Stra8、Ddx4和Tex14三種mRNA表達(dá)量均高于傳統(tǒng)誘導(dǎo)法的表達(dá)量。Westernblot檢測到兩種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)后的rBMSCs均表達(dá)STRA8、VASA,但傳統(tǒng)誘導(dǎo)法誘導(dǎo)rBMSCs后的STRA8和VASA4兩種蛋白的表達(dá)量低于改良誘導(dǎo)法的表達(dá)量。
　　結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可通過兩種不同的方法誘導(dǎo)為雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞,而改良誘導(dǎo)法的誘導(dǎo)效率高于傳統(tǒng)的生殖細(xì)胞誘導(dǎo)法。
　　第三

6、部分：體外誘導(dǎo)的雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(mGCLCs)體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)
　　目的:將改良誘導(dǎo)法誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)生成的mGCLCs移植入無精子癥大鼠模型的睪丸內(nèi),觀察細(xì)胞的生長能力及評價(jià)無精癥動物模型的生殖功能。
　　方法:50mg/kg環(huán)磷酰胺通過腹腔注入大鼠體內(nèi)建無精子癥模型,然后將10μl誘導(dǎo)后的雄性生殖細(xì)胞樣細(xì)胞通過DAPI標(biāo)記經(jīng)睪丸輸出小管移植入無精子癥大鼠,陰性對照組將同等劑量的生理鹽水注射入無精子