維生素D抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕子癇前期大鼠的心臟損傷.pdf

1、子癇前期是妊娠期特有疾病，發(fā)病率約為9.4-10.4％，存在多種并發(fā)癥如心臟損傷、腎臟損傷、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）、HELLP綜合征等。心臟損傷主要表現(xiàn)為左心室功能障礙，且存在威脅生命的風(fēng)險(xiǎn)，還增加了孕婦的死亡率，是全球公共健康問(wèn)題。盡管對(duì)子癇前期的研究進(jìn)行了多年，子癇前期仍無(wú)法預(yù)測(cè)。
　　維生素D對(duì)人體的益處得到基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)調(diào)查等方面的認(rèn)可。目前認(rèn)為維生素D不僅僅是一種營(yíng)養(yǎng)素，更是一種多效類(lèi)固醇激素，除傳統(tǒng)鈣穩(wěn)態(tài)作用外

2、還有免疫調(diào)節(jié)、腫瘤預(yù)防等作用。研究顯示，機(jī)體低維生素D水平是代謝綜合征及心血管疾病的危險(xiǎn)因素；維生素D缺乏增加孕婦發(fā)生子癇前期的幾率。流行病資料表明冬季孕婦子癇前期發(fā)病率高，可能與冬季因缺少陽(yáng)光照射、維生素D合成減少有關(guān)。
　　一項(xiàng)新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，孕鼠缺乏維生素D會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似子癇前期的臨床表現(xiàn)如高血壓、胎盤(pán)發(fā)育不良。更有進(jìn)一步研究提示，子癇前期模型大鼠孕早期補(bǔ)充維生素D對(duì)母體血壓、胎兒及胎盤(pán)產(chǎn)生有益影響。Gezmish曾報(bào)道，幼鼠

3、若缺乏維生素D，后期出現(xiàn)左心室肥大的風(fēng)險(xiǎn)增加，成鼠出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化。相關(guān)研究提示予以自發(fā)性高血壓大鼠1,25(OH)2D補(bǔ)充治療能夠降低心肌肥大程度、改善左心室容積等。流行病學(xué)調(diào)查顯示，維生素 D缺乏是心血管疾病危險(xiǎn)因素。但維生素D補(bǔ)充對(duì)心血管疾病的益處的證據(jù)尚不足，是否對(duì)子癇前期孕婦心血管系統(tǒng)產(chǎn)生多方面效益仍待評(píng)估。
　　本實(shí)驗(yàn)中的子宮胎盤(pán)灌注下降（RUPP）大鼠模型，模擬了子癇前期孕婦胎盤(pán)血管發(fā)育不良、胎盤(pán)低灌注的特點(diǎn)，并且

4、出現(xiàn)了類(lèi)似于子癇前期孕婦的臨床表現(xiàn)如高血壓、蛋白尿及心臟損害等。本研究應(yīng)用該模型旨在探究，維生素D的補(bǔ)充是否能夠改善RUPP大鼠的心臟損害，以期為臨床中子癇前期患者的維生素D治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：1,25(OH)2D改善RUPP大鼠臨床癥狀及心臟功能目的：分析1,25(OH)2D對(duì) RUPP大鼠血壓、尿蛋白和心功能的影響。
　　方法：
　　使用三月齡 SD懷孕大鼠建立子宮胎盤(pán)灌注下降模型（RUPP）。懷孕大

5、鼠分為為單純?nèi)焉锝M（NP group，10例)、RUPP手術(shù)組（RUPP group，10例）、RUPP手術(shù)+1,25(OH)2D組（RUPP+VD group，10例）。RUPP+VD組于懷孕1天、7天、14天，分別皮下注射120 ng/100 g
　　1.25(OH)2D，其他組皮下注射生理鹽水。在懷孕第14天， RUPP組和RUPP+VD組，予以麻醉后行血管狹窄術(shù)（致使子宮胎盤(pán)低灌注），NP組陰性操作。第19天測(cè)量動(dòng)脈血壓、

6、心臟功能，并留取尿、血標(biāo)本及心臟組織標(biāo)本。測(cè)定大鼠尿蛋白/肌酐水平，血清尿素氮、肌酐、鈣、磷、堿性磷酸酶水平。
　　結(jié)果：
　　1.1,25(OH)2D降低RUPP大鼠的血壓和尿蛋白/肌酐水平與NP組相比，RUPP組大鼠收縮壓顯著升高（164.30±12.60 mmHg vs.134.80±12.60 mmHg，P<0.001）；RUPP組大鼠24 h尿蛋白/肌酐增加（1.90±0.67 vs.0.83±0.30，P<0.0

7、1）。RUPP+VD組與 RUPP組相比，其收縮壓（148.10±11.40 mmHg vs.164.30±12.60 mmHg，P<0.05）和24 h尿蛋白/肌酐（0.85±0.22 vs.1.90±0.67，P<0.01）明顯降低。
　　大鼠血清堿性磷酸酶、尿素氮及肌酐水平在三組之間沒(méi)有顯著差異。RUPP+ VD組的大鼠血清鈣水平與NP組相比明顯升高（1.22±0.06 mmol/L vs.1.09±0.05 mmol/L，

8、P<0.01），與 RUPP組相比也明顯增高（1.22±0.06 mmol/Lvs.1.14±0.10 mmol/L，P<0.05）。
　　2.1,25(OH)2D改善RUPP大鼠心臟功能
　　超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明，與 NP組大鼠相比，RUPP大鼠心功能受損,包括左心室容積（舒張期）減少（197.90±50.22 ul vs.284.22±41.83ul，P<0.01）,左心室內(nèi)徑（舒張期）減少（6.21±0.75 mm vs

9、.7.32±0.48 mm， P<0.01）及左室前壁（舒張期）增厚（0.48±0.12 mm/100g vs.0.31±0.11 mm/100g，P<0.05）。超聲心動(dòng)圖數(shù)據(jù)顯示，與RUPP大鼠相比，RUPP+VD大鼠心功能改善,包括左心室容積（舒張期）增加（255.49±64.53 ul vs.197.90±50.22 ul，P<0.05）,左心室內(nèi)徑（舒張期）增加（6.95±0.82 mm vs.6.21±0.75 mm，P<0

10、.05）和左室前壁（舒張期）變薄（0.36±0.15 vs.0.48±0.12 mm/100g，P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.1,25(OH)2D降低RUPP大鼠的血壓和尿蛋白/肌酐水平，減輕子癇前期大鼠的癥狀。
　　2.1,25(OH)2D改善RUPP大鼠心臟功能。
　　第二部分：1,25(OH)2D減輕RUPP大鼠心肌組織損傷目的：了解補(bǔ)充1,25(OH)2D對(duì)RUPP大鼠心肌的影響。
　　方法

11、：
　　使用HE染色、透射電鏡觀察大鼠心臟組織和超微結(jié)構(gòu)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察維生素D受體(VDR),24-羥化酶（CYP24A1）在大鼠心臟中的表達(dá)。測(cè)定大鼠血漿腎素和血管緊張素Ⅱ水平，檢測(cè)大鼠心肌ANP、BNP、eNOS和iNOS基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.補(bǔ)充1,25(OH)2D改善RUPP大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)HE染色顯示，在NP組心肌細(xì)胞呈粉紅色，胞漿、胞核及組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌縱切面顯示肌纖維細(xì)長(zhǎng)呈圓柱

12、形，分支并互連成網(wǎng)，心肌纖維間有少量結(jié)締組織；RUPP大鼠組心肌組織水腫，細(xì)胞排列紊亂，胞核濃縮，纖維組織增生（Fig.1B,Fig.1A）；與RUPP組相比，RUPP+VD組心肌細(xì)胞排列較RUPP組整齊，胞核濃縮減輕，無(wú)明顯纖維組織增生(Fig.1B,Fig.1C）。
　　2.補(bǔ)充1,25(OH)2D改善RUPP大鼠心肌超微組織結(jié)構(gòu)電鏡結(jié)果顯示，在NP組心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體排列整齊結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體膜完整，嵴致密，基質(zhì)清晰，Z線(xiàn)整齊（F

13、ig.2A）；RUPP大鼠的心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，線(xiàn)粒體排列不整齊，數(shù)量減少，核間隙水腫明顯（Fig.2B）；與RUPP組相比，RUPP+VD組線(xiàn)粒體損傷降低，細(xì)胞核間隙的水腫減輕（Fig.2C）。
　　3.補(bǔ)充1,25(OH)2D增加RUPP大鼠心臟VDR表達(dá)免疫組織化學(xué)分析顯示，在大鼠心肌細(xì)胞中，RUPP組維生素D受體（VDR）蛋白表達(dá)高于NP組,而RUPP+VD組表達(dá)最高。在大鼠心臟中，VDR mRNA表達(dá)在三組大鼠心肌中沒(méi)有顯

14、著性差異。
　　4.補(bǔ)充1,25(OH)2D增加RUPP大鼠心臟CYP24A1的表達(dá)與RUPP組（P<0.01）及NP組（P<0.05）相比，RUPP+VD組大鼠心肌CYP24A1的mRNA表達(dá)明顯增加。
　　5.補(bǔ)充1,25(OH)2D影響RUPP大鼠血漿腎素和血管緊張素Ⅱ的水平放射免疫分析顯示，和 NP組相比，RUPP組的大鼠血漿腎素水平降低（P<0.01），RUPP+VD組的血漿腎素水平較 RUPP組明顯增加（P<0.

15、05）。RUPP組和RUPP+VD組的大鼠血漿血管緊張素Ⅱ的水平?jīng)]有明顯差異，RUPP+VD組的血漿血管緊張素Ⅱ水平較 NP組明顯下降（P<0.05）。
　　6.補(bǔ)充1,25(OH)2D對(duì)RUPP大鼠心肌ANP和BNP基因表達(dá)水平的影響ANP和BNP是心力衰竭嚴(yán)重程度的指標(biāo)，其基因表達(dá)在三組大鼠心肌中無(wú)顯著性差異。
　　7.補(bǔ)充1,25(OH)2D對(duì)RUPP大鼠心肌eNOS和iNOS基因表達(dá)水平的影響ENOS和iNOS是血管

16、內(nèi)皮損傷的指標(biāo)，其基因表達(dá)在三組大鼠心肌中無(wú)顯著性差異。
　　小結(jié)：
　　1.補(bǔ)充1,25(OH)2D改善RUPP大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)損傷。
　　2.補(bǔ)充1,25(OH)2D增加RUPP大鼠心臟VDR和CYP24A1的表達(dá)。
　　3.補(bǔ)充1,25(OH)2D對(duì)RUPP大鼠心肌ANP、BNP、eNOS和iNOS基因表達(dá)水平?jīng)]有影響。
　　第三部分 1,25(OH)2D抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕RUPP大鼠心臟損傷

17、目的：研究1,25(OH)2D影響 RUPP大鼠心肌細(xì)胞功能的可能機(jī)制。方法：應(yīng)用 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平，應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白在大鼠心臟中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.1,25(OH)2D降低RUPP組大鼠心臟的氧化應(yīng)激水平HO-1,P47-phox,P22-phox, HIF-1α是氧化應(yīng)激指標(biāo)，它們?cè)谌M大鼠心肌中的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有差異。免疫組織化

18、學(xué)分析顯示，在心肌細(xì)胞中，氧化應(yīng)激標(biāo)記物P47-phox（P<0.001）和p-P47 phox（P<0.001）在RUPP組的表達(dá)較NP組明顯升高。與RUPP組相比，RUPP+VD組P47-phox（P<0.001）和p-P47 phox（P<0.001）的表達(dá)明顯降低。
　　2.1,25(OH)2D降低了RUPP組大鼠心臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平免疫組織化學(xué)分析顯示，在大鼠心肌細(xì)胞中，CHOP（P<0.001）和GRP78（P<0.0

19、01）在RUPP組的表達(dá)較NP組明顯升高。與RUPP組相比，RUPP+VD組 CHOP（P<0.001）和 GRP78（P<0.001）的表達(dá)明顯降低。
　　3.1,25(OH)2D抑制RUPP組大鼠心肌的線(xiàn)粒體凋亡水平免疫組織化學(xué)分析顯示，與NP組相比，RUPP組Caspase9（P<0.001）和Cleaved Caspase9（P<0.001）的蛋白表達(dá)水平顯著增加。RUPP+VD組Caspase9（P<0.001）和Cle

20、aved Caspase9（P<0.001）的蛋白表達(dá)水平較 RUPP組明顯降低。
　　4.1,25(OH)2D降低RUPP組大鼠心肌Caspase12的表達(dá)水平免疫組織化學(xué)分析顯示，與NP組相比RUPP組Caspase12（P<0.001）的蛋白表達(dá)水平顯著增加。RUPP+VD組Caspase12（P<0.001）的蛋白表達(dá)水平較 RUPP組明顯降低。
　　5.1,25(OH)2D降低RUPP組大鼠心肌Cleaved Ca

21、spase3的表達(dá)水平免疫組織化學(xué)分析顯示，與NP組相比，RUPP組和RUPP+VD組的Caspase3蛋白表達(dá)顯著減低（P<0.001）。但與此同時(shí)，Cleaved Caspase3的蛋白表達(dá)在NP組是低的，在RUPP組它的表達(dá)明顯高于NP組（P<0.001），導(dǎo)致較多的凋亡。與 RUPP組相比，給予1,25(OH)2D明顯降低了Cleaved Caspase3的蛋白表達(dá)（P<0.001），表明在 RUPP+VD組細(xì)胞凋亡減少。

22、>　　6.1,25(OH)2D抑制RUPP組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡水平TUNEL圖像顯示凋亡細(xì)胞，在NP組偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，在RUPP組可見(jiàn)較多被染成紅色熒光的凋亡細(xì)胞。與 RUPP組相比，RUPP+VD組凋亡細(xì)胞減少。
　　小結(jié)：
　　1,25(OH)2D通過(guò)抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕RUPP大鼠心臟損傷，從而改善其心臟功能。
　　結(jié)論：
　　1.1,25(OH)2D改善RUPP大鼠臨床癥狀及心臟功能。
　　2.