維生素D通過抑制胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡改善子癇前期的妊娠結(jié)局.pdf

1、子癇前期是一種妊娠特異性疾病，發(fā)病率約為3-5％，會引起孕婦高血壓、蛋白尿和水腫，胎兒早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和窒息，居孕產(chǎn)婦和圍生期胎兒發(fā)病率和死亡率首位。因子癇前期的發(fā)病機制不明，至今仍無法做到有效的防治，唯一的方法就是移除致病的胎盤，例如分娩。
　　臨床研究顯示，子癇前期孕婦中血清25(OH)D的水平下降，而維生素D缺乏的孕婦患子癇前期的風險增加。因此，冬季因為由陽光的減少所致維生素D合成減少，孕婦患子癇前期的風險更高。動物實驗也

2、證實，低維生素D水平會導(dǎo)致孕鼠子癇前期的癥狀，包括高血壓和胎盤功能下降等。然而，孕期補充維生素D是否會減輕子癇前期的癥狀？如有改善，這種改善與哪些生物大分子的活性變化有關(guān)，還未知。
　　大鼠子宮胎盤灌注壓下降(RUPP)模型可以模擬人類子癇前期的胎盤灌注壓下降，引起與人類子癇前期相同的表型，是公認的子癇前期模型。因此，我們選取RUPP模型大鼠為研究對象，通過以下三個部分的研究：
　　（1）觀察子癇前期孕婦血清維生素D和胎盤維

3、生素D受體的水平，以及與胎盤和胎兒生長發(fā)育的關(guān)系；
　?。?）證明孕早期補充維生素D對RUPP大鼠子癇前期癥狀具有改善作用；
　?。?）維生素D改善RUPP大鼠子癇前期癥狀的分子機制。通過上述三個部分的研究，證實孕早期補充維生素D可以改善RUPP大鼠的子癇前期癥狀，從組織器官水平尋找維生素D改善子癇前期癥狀的作用靶點和分子機制。為維生素D應(yīng)用于臨床子癇前期的防治提供實驗依據(jù)。
　　第一部分：子癇前期孕婦血維生素D和胎盤

4、維生素D受體的水平
　　目的：
　　分析子癇前期孕婦血維生素D以及胎盤維生素D受體水平與子癇前期不良結(jié)局的關(guān)系。
　　方法：
　　選取臨床診斷為子癇前期的病例，收集子癇前期（PE組，25例）和正常妊娠婦女（NT組，32例）的母血，臍血和胎盤；測量母血中鈣、磷、堿性磷酸酶的水平，母血和臍血中25(OH)D的水平；檢測胎盤的VDR,CYP27B1,CYP24A1的水平；分析VDR mRNA表達和臍血中25(OH)D、

5、胎盤重量、新生兒體重、身長的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.PE組和NT組孕婦臨床指標比較正常妊娠孕婦（NT組，32例）平均年齡為28.31±4.62歲，子癇前期孕婦（PE組，25例）的平均年齡年齡為27.92±6.35歲，兩組年齡無差異。兩組具有可比性。
　　1.1.PE組符合臨床對子癇前期的診斷標準PE組血壓明顯升高（收縮壓172.46±21.12 mm Hg，舒張壓（115.67±19.11 mmHg），NT組血壓均

6、在正常范圍（收縮壓112.67±11.68 mm Hg，舒張壓69.33±9.02 mmHg）。兩組比較有明顯差異（P<0.01）。PE組均出現(xiàn)明顯蛋白尿（1.83±0.34 g/24h），NT組沒有或僅有微量蛋白尿，兩組比較有明顯差異（P<0.01）。
　　1.2.PE組的胎盤重量，新生兒的體重、身長等較NT組低PE組的胎盤重量較輕（494.12±88.18 g），與NT組孕婦（565.19±85.23g）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

7、（P<0.05）。PE組與NT組新生兒的胎齡無明顯差異。PE組胎齡36.03±2.16周， NT組胎齡38.62±2.16周。PE組的新生兒體重明顯下降（2.60±0.69 kg），NT組的新生兒體重在正常范圍（3.31±0.40 kg），兩組比較有顯著差異（P<0.01）。PE組的新生兒身長低于正常范圍（47.25±2.19 cm），NT組的新生兒身長在正常范圍（50.00±1.20 cm），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。表明

8、PE組分娩的新生兒經(jīng)常出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩和低出生體重。
　　1.3.PE組和NT組孕婦血中鈣、磷、堿性磷酸酶水平無明顯區(qū)別PE組血清鈣正?；蛟谡７秶拖蓿?.09±0.20 mmol/L），與NT組相比（2.17±0.10 mmol/L），血鈣輕度下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。PE組血清中磷、堿性磷酸酶水平輕度升高（分別為1.20±0.23 mmol/L，157.1±49.7 mmol/L），但與NT組孕婦比較（分別為1.17±0.18

9、 mmol/L，143.76±40.68 mmol/L），沒有明顯差異。
　　2.PE組血清及臍血中25(OH)D濃度明顯低于NT組PE組血清中25(OH)D濃度(35.21±6.65 nmol/L)，較NT組孕婦的濃度(46.09±8.88 nmol/L)低，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PE組臍血中25(OH)D濃度(31.44±5.61 nmol/L)，較 NT組的濃度(42.00±14.96 nmol/L)低，兩組

10、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。臍血中25(OH)D濃度與母血中25(OH)D濃度有很強的正相關(guān)（R=0.825，P<0.05）。表明，臍血中25(OH)D來源于母血。
　　3.PE組和NT組胎盤中維生素D的代謝酶的改變與NT組相比，1α-羥化酶CYP27B1的mRNA表達在PE組胎盤中輕度下降，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣，24-羥化酶CYP24A1基因的mRNA表達在PE組胎盤中也有下降趨勢，但和NT組胎盤相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意

11、義。和NT組胎盤相比，VEGF的mRNA表達在PE組胎盤中明顯下降，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。VEGF的mRNA表達水平與胎盤重量有一定的正相關(guān)（R=0.361，P<0.05）。
　　4.PE組胎盤維生素D受體（VDR）蛋白表達升高和NT組胎盤相比，VDR在PE組胎盤中的mRNA表達有一定程度的升高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Western blotting結(jié)果顯示，PE組胎盤中VDR蛋白表達比NT組胎盤高。免疫組織化學(xué)

12、的結(jié)果與之相符，VDR在PE組胎盤滋養(yǎng)層細胞中深染高表達。
　　5.胎盤中維生素D受體（VDR）mRNA水平與臍血25(OH)D，胎盤重量，新生兒出生體重和身長的關(guān)系胎盤VDR的mRNA水平與母血中25(OH)D水平無相關(guān)性（R=-0.130，P=0.322）。VDR的mRNA表達水平與臍血中25(OH)D水平呈一定的負相關(guān)（R=-0.405，P<0.05）。VDR的mRNA表達水平與胎盤重量有負相關(guān)（R=-0.523，P<0.0

13、5）；與新生兒的出生體重和身長也呈一定的負相關(guān)（分別為R=-0.419，P<0.05；R=-0.427，P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.子癇前期孕婦血清和臍血中25(OH)D處于低水平狀態(tài)。
　　2.低水平的維生素D很可能與胎盤、胎兒生長發(fā)育不良有關(guān)。
　　第二部分：1,25(OH)2D改善RUPP大鼠模型母體及胎兒的妊娠結(jié)局
　　目的：
　　證明孕早期補充1,25(OH)2D可改善RUPP大鼠

14、的不良妊娠結(jié)局。
　　方法：
　　使用三月齡SD孕大鼠建立子宮胎盤灌注下降模型（RUPP）。懷孕大鼠分為為單純?nèi)焉锝M（NP group，12例)、 RUPP手術(shù)組（RUPP group，14例）、RUPP手術(shù)+1,25(OH)2D組（RUPP+VD group，15例）。RUPP+VD組分別于懷孕1天、7天、14天進行1,25(OH)2D注射液(injectable Calcijex,1mg/mL; Abbott Labor

15、atories)皮下注射，劑量120 ng/100 g wt./wk。于孕19天時，測量大鼠尿蛋白、心臟超聲、動脈血壓，觀察胎兒、胎盤情況。測定大鼠血清中腎功能、血脂、血糖、鈣、磷、堿性磷酸酶水平。使用透射電鏡觀察大鼠胎盤、心臟、腎臟超微結(jié)構(gòu)。觀察了VDR, CYP24A1在大鼠胎盤、心臟、腎臟中的表達。
　　結(jié)果：
　　1.補充1,25(OH)2D可以改善RUPP大鼠的子癇前期癥狀和胎兒胎盤的發(fā)育
　　RUPP組大鼠

16、的血壓（131.17±8.01 mmHg vs.110.44±7.88mmHg，P<0.001），尿蛋白肌酐比值（1.90±0.67 vs.0.83±0.30，P<0.01），尿微量白蛋白濃度（85.63±26.39 mg/L vs.25.40±7.35 mg/L，P<0.05）都較NP組高；給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的血壓（122.57±4.32 mmHg， P<0.05）、尿蛋白肌酐比值（0.85±0.22， P<

17、0.01），尿微量白蛋白濃度（21.31±3.89 mg/L，P<0.05）都較RUPP組低。表明，補充1,25(OH)2D可以改善RUPP大鼠的子癇前期癥狀。
　　RUPP組大鼠的胎兒死亡率（0.84±0.16 vs.0.11±0.04，P<0.001）較NP組高，總的胎盤重量（0.49±0.24 g vs.4.68±1.76 g，P<0.001）和胎兒重量（2.27±0.50g vs.27.08±5.26 g，P<0.001）

18、較NP組低。給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的胎兒死亡率（0.65±0.27, P<0.05）明顯下降，總的胎盤重量（1.66±0.48 g，P<0.05）和胎兒重量（8.96±2.78 g，P<0.05）增加。但是，由于RUPP組的胎兒數(shù)量明顯下降，RUPP和RUPP+VD組的平均胎盤和胎兒重量沒有區(qū)別。表明，補充1,25(OH)2D可以改善RUPP大鼠的胎兒和胎盤的發(fā)育。
　　比較其它反映腎功能的指標，血清中尿素氮

19、水平，NP組，RUPP組，RUPP+VD組分別為6.26±1.58 mmol/L，6.23±1.12 mmol/L，
　　6.23±1.04 mmol/L，無明顯差異。血清中肌酐水平，三組分別為56.35±16.39 mmol/L，60.78±25.42 mmol/L，62.82±26.62 mmol/L，差異不明顯。RUPP+VD組的血清游離鈣水平（1.22±0.06 mmol/L），與 NP組（1.08±0.06 mmol/L

20、，P<0.001）和RUPP組（1.14±0.10 mmol/L，P<0.05）相比，均有明顯的升高。提示大鼠子癇前期癥狀的緩解與給予1,25(OH)2D有關(guān)。
　　2.補充1,25(OH)2D可以改善RUPP大鼠母體的心、腎和胎盤組織損傷
　　2.1.補充1,25(OH)2D可以減輕心肌細胞線粒體的損傷心臟超聲顯示，和NP組相比，RUPP組大鼠的左心室舒張末期容積（227.03±59.86 ul vs.282.20±37.

21、68 ul，P<0.05），左心室收縮期內(nèi)壁直徑明顯下降（3.23±0.57 mm vs.3.81±0.66 mm，P<0.05），左心室舒張期前壁厚度/體重（分別為0.00446±0.00067 vs.0.00306±0.00062，P<0.05）、左心室收縮期后壁厚度/體重明顯升高（0.01146±0.0016 vs.0.00819±0.00084，P<0.05）。但是，心臟射血分數(shù)在三組之間沒有明顯差異，表明在RUPP組大鼠中心功

22、能損傷不明顯。而且，這些數(shù)據(jù)在RUPP+VD組和RUPP組兩組之間沒有明顯差異。
　　大鼠心肌纖維的連接處稱為閏盤，著色較深，在光鏡下呈橫形或階梯狀粗線。心肌細胞的核呈卵圓形，位于中央，有的含有雙核。其胞漿比較豐富，多在核的兩端處。在HE染色切片中，NP組，RUPP組，RUPP+VD組的大鼠心臟的結(jié)構(gòu)無明顯形態(tài)學(xué)差異。
　　在電鏡下，NP組的大鼠心肌細胞，含有粗、細兩種肌絲和肌節(jié)，由粗、細肌絲形成肌絲束。細胞有分支，相鄰肌纖

23、維呈端端連接。心肌纖維核1-2個，橢圓形，常位于細胞中央。線粒體多，縱行排列，體積大，嵴密集。在心肌細胞的橫切面上，可見心肌肌絲間有肌質(zhì)網(wǎng)囊管和線粒體無規(guī)則分布。在RUPP組，有些心肌細胞的線粒體出現(xiàn)改變，其大部分嵴和部分膜融合、模糊，部分嵴消失。基質(zhì)內(nèi)明顯水腫，可見大小不等的空泡。肌膜下膠原纖維明顯增生、水腫。細胞器數(shù)量減少。局部核周水腫。RUPP+VD組，一部分心肌細胞的線粒體出現(xiàn)改變，線粒體少數(shù)嵴融合、模糊不清，核一側(cè)基質(zhì)內(nèi)水腫，

24、結(jié)締組織明顯水腫。表明給予1,25(OH)2D后，RUPP+VD組的線粒體損傷得到緩解。
　　PCR結(jié)果顯示，大鼠心臟中VDR的表達在三組之間沒有明顯差異。然而，作為VDR的下游基因， CYP24A1的表達在RUPP+VD組明顯升高（P<0.05），提示線粒體結(jié)構(gòu)損傷的改善與給予1,25(OH)2D有關(guān)，可能通過VDR的基因途徑調(diào)節(jié)。
　　2.2.補充1,25(OH)2D減輕RUPP組大鼠腎小球損傷大鼠腎臟在光鏡下可見腎小體

25、和腎小管。腎小體由血管球和腎小囊組成。血管球是一團毛細血管簇，呈球狀，位于腎小囊中。在石蠟切片HE染色照片中，和NP組相比，RUPP組中腎臟組織的腎小球萎縮，腎小囊囊腔增大。RUPP+VD組中腎小球無明顯萎縮，表明給予1,25(OH)2D后，腎小球損傷減輕。
　　在電鏡下，NP組的大鼠腎小球濾過膜的三層結(jié)構(gòu)分別為血管內(nèi)皮細胞、基膜和足細胞。血管內(nèi)皮細胞上有圓形小孔。內(nèi)皮細胞之外有一層基膜，電鏡下基膜可分三層，中層電子密度較大，稱為

26、致密層，兩側(cè)電子密度較小，為內(nèi)、外疏松層。足細胞是腎小囊臟層的上皮細胞，結(jié)構(gòu)特殊，胞體很大。足細胞從胞體伸出較大的初級突起，每個初級突起又分成指狀次級突起，緊貼在基底膜外面。足突相互穿插成柵欄狀。電鏡圖片顯示，在RUPP組中，腎小球濾過膜出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為足突大部分融合，基膜高度增生，呈丘狀隆起。給予1,25(OH)2D后，這些損傷在RUPP+VD組部分得到緩解，足突近一半融合，基膜輕度增生。與RUPP組相比，給予1,25(OH)2D后，

27、RUPP+VD組的基膜增生和足突融合減輕。
　　PCR結(jié)果顯示，大鼠腎臟中VDR的表達在三組之間沒有明顯差異。然而，作為VDR的下游基因，CYP24A1的表達在RUPP+VD組明顯升高（P<0.05），提示腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改善與給予1,25(OH)2D有關(guān)，可能通過VDR的基因途徑調(diào)節(jié)。
　　2.3.補充1,25(OH)2D可以減輕RUPP組大鼠胎盤的滋養(yǎng)層細胞損傷大鼠胎盤從母面到子面分為蛻膜層、巨細胞滋養(yǎng)層、海綿滋養(yǎng)層和迷

28、路滋養(yǎng)層。迷路滋養(yǎng)層中多為絨毛，呈樹狀分支，外層由滋養(yǎng)層細胞覆蓋，軸心為富含血管的結(jié)締組織。HE染色顯示，在大鼠胎盤的各部分結(jié)構(gòu)中，絨毛部分在三組之間的差異最大。和NP組相比，在RUPP組中，絨毛的滋養(yǎng)層細胞萎縮，核橢圓形，深染。給予1,25(OH)2D后，在RUPP+VD組中，滋養(yǎng)層細胞的萎縮減輕，核圓形，深染區(qū)減少。
　　在電鏡下，NP組的大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞，表面可見微絨毛，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)可見線粒體、核糖體和高爾基復(fù)合體。其

29、核大，著色淡，染色質(zhì)顆粒細，核仁明顯。和NP組相比，RUPP組的部分滋養(yǎng)層細胞核不規(guī)則，有的出現(xiàn)核輕度固縮，異染色質(zhì)增多。細胞器數(shù)量（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等）明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體嵴、膜部分融合消失，有髓樣化表現(xiàn)。微絨毛明顯減少，有的從細胞上脫出。RUPP+VD組，少部分滋養(yǎng)層細胞核不規(guī)則，異染色質(zhì)輕度增多。線粒體輕度嵴、膜融合，微絨毛數(shù)量減少。與RUPP組相比，RUPP+VD組的細胞核形態(tài)較規(guī)則，異染色質(zhì)減少，線粒體損傷減輕，

30、微絨毛較多。
　　PCR結(jié)果顯示，和NP組和RUPP+VD組相比，大鼠胎盤中VDR的表達在RUPP組中升高（P<0.05）。作為VDR的下游基因，CYP24A1在三組之間的表達沒有明顯差異。由此推測，1,25(OH)2D可能在胎盤中通過VDR的非基因途徑發(fā)揮作用。
　　組化結(jié)果顯示，在胎盤中，和其它部分相比，絨毛部分的VDR蛋白水平的表達更明顯。RUPP組中絨毛的VDR表達比NP組升高， RUPP+VD組的表達更高。這些結(jié)果

31、顯示，胎盤結(jié)構(gòu)和功能的改善，與VDR有關(guān)。3補充1,25(OH)2D可以降低RUPP大鼠母體的高血糖
　　1,25(OH)2D可以降低RUPP大鼠的高血糖。試驗發(fā)現(xiàn)，RUPP組普遍出現(xiàn)了高血糖（12.73±4.00 mmol/L），其血糖水平比 NP組（8.05±2.81 mmol/L）明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。RUPP+VD組的血糖水平顯著下降（10.01±2.09mmol/L，P<0.05）。
　　RU

32、PP組和RUPP+VD組的血脂水平出現(xiàn)改變。比較血清中總膽固醇含量，RUPP組（1.43±0.16 mmol/L）、RUPP+VD組（1.62±0.30 mmol/L）和NP組（2.03±0.27 mmol/L）相比，均有顯著下降（分別為P<0.01，P<0.05）。血中甘油三酯水平，RUPP組（0.90±0.53 mmol/L）和NP組（3.14±1.79 mmol/L）相比，明顯下降（P<0.05）。RUPP+VD組中甘油三酯水平（

33、1.60±0.69 mmol/L）也較NP組下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　小結(jié)：
　　妊娠早期給予 RUPP大鼠1,25(OH)2D，有助于改善孕鼠及胎兒的妊娠結(jié)局。
　　第三部分：1,25(OH)2D通過抑制凋亡和上調(diào)自噬，減輕RUPP大鼠胎盤的滋養(yǎng)層細胞受損
　　目的：
　　證明1,25(OH)2D通過改善RUPP大鼠胎盤的滋養(yǎng)層細胞的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而抑制凋亡和上調(diào)自噬。
　　方法：
　

34、　應(yīng)用DHE檢測大鼠胎盤中活性氧（ROS）水平，TUNEL法檢測胎盤中細胞凋亡水平，應(yīng)用Western blot和免疫組化法檢測氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和自噬相關(guān)標志蛋白在大鼠胎盤中的表達。
　　結(jié)果：
　　1.1,25(OH)2D降低了RUPP組大鼠胎盤的氧化應(yīng)激水平
　　與 NP組相比，RUPP組的ROS水平升高。給予1,25(OH)2D后， RUPP+VD組的ROS水平降低。P47-phox作為氧化應(yīng)激的標志物

35、，它的mRNA和蛋白水平，在RUPP組升高。給予1,25(OH)2D后，P47-phox mRNA和蛋白水平降低。免疫組化顯示，P47-phox主要在胎盤滋養(yǎng)層細胞的胞漿中表達（棕黃色顆粒）。表明1,25(OH)2D主要降低了RUPP組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的氧化應(yīng)激水平。
　　2.1,25(OH)2D降低RUPP組大鼠胎盤的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平
　　免疫組化和western的結(jié)果顯示，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志物GRP78, CHOP和C

36、aspase12，它們的蛋白表達水平，在RUPP組胎盤中明顯升高。給予1,25(OH)2D后，GRP78, CHOP和Caspase12的蛋白表達水平明顯下降。免疫組化圖片顯示，GRP78、Caspase12主要在胎盤滋養(yǎng)層細胞的胞漿中表達（棕黃色顆粒），CHOP主要在胎盤滋養(yǎng)層細胞的胞漿和胞核中表達。表明1,25(OH)2D主要降低了RUPP組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。
　　3.1,25(OH)2D降低了RUPP組大鼠

37、胎盤細胞的凋亡水平
　　在熒光顯微鏡下，DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色。只在凋亡的細胞核中才有Bright Green摻入而產(chǎn)生的綠色熒光。重疊后的青色代表凋亡的細胞核。在NP組中，標記藍色熒光的核較大，幾乎沒有凋亡的細胞核，表明凋亡細胞較少。在RUPP組中，可以看到部分細胞核萎縮，凋亡的細胞核散在出現(xiàn)，表明部分細胞出現(xiàn)凋亡。RUPP+VD組中，萎縮的細胞核減少，凋亡的細胞核也減少，表明發(fā)生凋亡的細胞減少。
　　免

38、疫組化結(jié)果顯示，總Caspase3在RUPP組和RUPP+VD組中的表達都較NP組低，但1,25(OH)2D會明顯降低活化的Caspase3的表達水平。這和TUNEL結(jié)果是一致的。Caspase3和活化的Caspase3主要在胎盤滋養(yǎng)層細胞的胞漿和胞核中表達。表明1,25(OH)2D主要降低了RUPP組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的凋亡水平。
　　4.1,25(OH)2D增加RUPP組大鼠胎盤細胞的自噬水平
　　Western的結(jié)果顯

39、示，與NP組相比，作為自噬標志物的Beclin1和LC3B-II的蛋白表達水平在RUPP組中降低，在RUPP+VD組中表達水平最高。免疫組化圖片顯示，Beclin1的蛋白表達，也在RUPP+VD組中增高。Beclin1和LC3B主要在胎盤滋養(yǎng)層細胞的胞漿中表達。表明1,25(OH)2D主要增加了RUPP組大鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的自噬水平。
　　小結(jié)：
　　1,25(OH)2D通過抑制凋亡和上調(diào)自噬，減輕RUPP大鼠胎盤的滋養(yǎng)層細