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文檔簡介
1、乳糖酶(β-D-半乳糖苷酶,β-D-galactoside-galactohydrolase,EC3.2.1.23)為一種水解酶,可以將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖,目前廣泛應用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領域。冷適應乳糖酶具有在低溫下高活性的優(yōu)點,應用在乳品加工和乳清引起的環(huán)境污染治理等方面,有著中溫和高溫乳糖酶無法達到的優(yōu)越性。同時南極地區(qū)被認為是一個潛在的、重要的微生物資源庫,可能是產生新型生物活性物質和先導化合物菌株的潛在種源地。我們實驗室
2、從采集自南極的海泥樣品中篩選到33株酵母菌,本實驗在15℃條件下,采用X-gal定性試驗和ONPG定量試驗從這33株酵母中篩選產乳糖酶的菌株,結果篩選到1株高產乳糖酶菌株17-1,經酵母菌常規(guī)方法和分子生物學方法鑒定,我們將其鑒定為一株普魯蘭久浩酵母(Guehomyces pullulans)。
研究發(fā)現(xiàn),G. pullulans17-1菌株可同時產胞外和與細胞結合的(Cell-bound)乳糖酶,根據(jù)溫度對菌體生長的影響
3、,我們判定菌株17-1為一株耐冷型酵母。對耐冷酵母G. pullulans17-1菌株產乳糖酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,確定了最佳培養(yǎng)基成分為(w/v):乳糖3.0%,酵母粉0.7%,蛋白胨0.3%,紫蘇油0.02%,KH2PO40.28%,MgSO4·7HO20.06%,MnSO4·3HO20.00085%,培養(yǎng)基初始pH為4.5,蒸餾水配制;最佳培養(yǎng)條件為:15℃、170rpm振蕩培養(yǎng)132h,此時耐冷酵母G. pullulan
4、s17-1菌株乳糖酶總產量可達13.9U/mL。對發(fā)酵罐高密度發(fā)酵產酶條件進行了初探,實驗結果表明可以將該乳糖酶的總產量提高到25.3U/mL。用粗酶樣品水解乳糖溶液,水解產物為葡萄糖和半乳糖,水解牛奶可產生大量還原糖。
G. pullulans17-1菌株胞外乳糖酶經超濾法濃縮、SephadexTMG-200凝膠過濾、CM-Sepharose F.F.陽離子交換層析得到了純化,比活力提高2.4倍。SDSPAGE顯示其單亞
5、基分子量約為170.0kDa,用凝膠過濾層析法測得該純化酶的分子量約為335.0kDa,因此推測G pullulans17-1菌株乳糖酶是一個同源二聚體。對該純化酶的酶學性質進行了研究,結果表明:其最適作用溫度和pH分別為50℃和4.0,受Ag+、Hg2+的強烈抑制(8.2%,8.4%),Li+離子對它有一定激活作用,對底物ONPG的Km值和Vmax分別為3.3mM和9.2μmol/min。一級蛋白質譜分析表明,該乳糖酶的一個肽片ALE
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