蛹蟲(chóng)草凝集素編碼基因外源表達(dá)產(chǎn)物的活性研究及Nem1基因功能初探.pdf

1、蛹蟲(chóng)草具有抗腫瘤、抗衰老和明顯增強(qiáng)人體非特異性免疫系統(tǒng)的作用，在我國(guó)作為食藥用真菌而被廣泛應(yīng)用。加強(qiáng)蛹蟲(chóng)草活性成分的研究，以及各成分相關(guān)基因的研究有助于更好地開(kāi)發(fā)其藥理功效，為其生物合成提供科學(xué)基礎(chǔ)。
　　凝集素是一種非免疫來(lái)源的糖結(jié)合蛋白，能使細(xì)胞凝集或糖綴合物(glycoconjugate)沉淀。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蛹蟲(chóng)草中凝集素的研究報(bào)道屈指可數(shù)，而且現(xiàn)有報(bào)道僅限于直接從子實(shí)體中分離純化和生物學(xué)活性檢測(cè)的基礎(chǔ)研究，還沒(méi)有對(duì)蛹蟲(chóng)草

2、中凝集素基因方面的研究。
　　在前期工作中，本研究團(tuán)隊(duì)從蛹蟲(chóng)草基因組中通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘獲得了一個(gè)編碼Jacalin類(lèi)凝集素的基因JRL-ccm4，在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)該凝集素編碼基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及原核異源表達(dá)，構(gòu)建了高效異源表達(dá)體系，檢測(cè)了異源表達(dá)的凝集素的生物活性，并測(cè)定了蛹蟲(chóng)草不同生長(zhǎng)時(shí)期該凝集素編碼基因的表達(dá)水平。從生物信息學(xué)分析結(jié)果看，JRL-ccm4不同于之前報(bào)道的任何一種蛹蟲(chóng)草凝集素，為蛹蟲(chóng)草中又一新型凝集素，這表

3、明蛹蟲(chóng)草中可能存在多種凝集素。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，JRL-ccm4基因在大腸桿菌中成功表達(dá)出來(lái)，分子量與預(yù)測(cè)大小一致，且表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白，可以直接用于多種生物學(xué)活性的檢測(cè)。不同凝集素存在各種不同的特異性識(shí)別位點(diǎn)，所以其凝集活性表現(xiàn)在能夠凝集除紅細(xì)胞外的多種細(xì)胞，通過(guò)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)JRL-ccm4蛋白可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，而不能影響大腸桿菌的生長(zhǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明JRL-ccm4具有一定的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，當(dāng)?shù)鞍滋崛∫簼?/p>

4、度為1.8mg/mL時(shí)，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的抑制率為11.7％，并且嚴(yán)重影響腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。檢測(cè)JRL-ccm4基因在蛹蟲(chóng)草不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)量，結(jié)果顯示JRL-ccm4在原基形成階段表達(dá)量最高，其次是成熟子實(shí)體階段，分別為菌絲體生長(zhǎng)階段的3.49倍和1.46倍，這表明JRL-ccm4可能在蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育中起到一定的調(diào)控作用。該研究結(jié)果為從分子層面深入了解蛹蟲(chóng)草凝集素的功能和開(kāi)發(fā)利用提供了工作基礎(chǔ)。
　　本研究為揭示

5、Nem1基因在蛹蟲(chóng)草中的功能，運(yùn)用含有不同交配型基因的菌株分別構(gòu)建了Nem1基因缺失菌株及基因回補(bǔ)菌株；通過(guò)觀察Nem1基因敲除對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株生長(zhǎng)過(guò)程中脂代謝的影響，對(duì)栽培過(guò)程中農(nóng)藝性狀的影響，以及對(duì)菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)和侵染毒力的影響，探究基因功能；考慮到Nem1基因是脂代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵基因，本研究運(yùn)用qPCR技術(shù)對(duì)基因缺失菌株中細(xì)胞自噬相關(guān)基因進(jìn)行了定量實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)同源重組的方法敲除蛹蟲(chóng)草CM091和CM0

6、92中的Nem1基因獲得了基因缺失突變株1ΔNem1和2ΔNem1。將Nem1全基因序列隨機(jī)插入到基因缺失突變株基因組中獲得回補(bǔ)菌株Comp1和Comp2。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，我們認(rèn)為Nem1蛋白更可能分布于細(xì)胞核膜及細(xì)胞質(zhì)膜上?；蛉笔蛔冎?ΔNem1和2ΔNem1的生長(zhǎng)速度分別比野生菌株CM091和CM092下降了41.2%、61.76%，并且栽培后不能出草，說(shuō)明Nem1能夠嚴(yán)重影響蛹蟲(chóng)草菌絲的正常生長(zhǎng)以

7、及子實(shí)體的正常分化；同時(shí)Nem1基因?qū)τ枷x(chóng)草分生孢子的產(chǎn)生及孢子萌發(fā)過(guò)程有影響。利用聚苯乙烯硬質(zhì)疏水表面誘導(dǎo)附著胞形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在野生菌株和Nem1敲除菌株的孢子萌發(fā)24h左右，都能正常形成附著胞；綜合對(duì)菌絲中幾丁質(zhì)酶和蛋白酶基因定量結(jié)果說(shuō)明Nem1基因的敲除并不影響蛹蟲(chóng)草對(duì)宿主的侵染能力。熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因缺失突變株細(xì)胞核形態(tài)異常，說(shuō)明Nem1蛋白在細(xì)胞核形態(tài)建成中起重要作用；突變株菌絲中的脂質(zhì)含量明顯減少，說(shuō)明Nem1基因影響了