線粒體DNA編碼蛋白質在炎癥反應中作用的初步探討.pdf

1、第一部分，目的：創(chuàng)傷導致機體出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征,甚至發(fā)生多器官功能衰竭。目前認為創(chuàng)傷后大量線粒體破裂,線粒體內由其自身DNA編碼合成的蛋白質釋放入血,是導致無菌性炎癥的重要因素。細胞色素b是由線粒體DNA編碼合成的一種蛋白質。本文通過動物實驗分析細胞色素b和炎癥反應相關性、體內實驗細胞色素b活化巨噬細胞釋放炎癥因子的檢測、體外實驗大鼠膝關節(jié)腔內注射細胞色素b誘導關節(jié)炎發(fā)生三部分,初步探討細胞色素b在無菌性炎癥反應中所起的作用,為嚴重

2、創(chuàng)傷后SIRS的發(fā)生、多器官損傷及相關并發(fā)癥的研究提供新思路。
　　方法：第一部分動物實驗:制備大鼠雙側股骨干骨折模型,分別在創(chuàng)傷后第1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)觀測外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表達;第二部分體外實驗:將大鼠腹腔巨噬細胞分為培養(yǎng)基對照組、mtDNA(10ug/ml)組;Cyt-b(0.1ug/ml)組、Cyt

3、-b(1ug/ml)組、Cyt-b(10ug/ml)組共5組進行刺激,分別在0小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時和36小時,用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)觀測培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6、的表達水平;第三部分動物實驗將大鼠分為空白對照(緩沖液)組、mtDNA(10ug/ml)組、Cyt-b(10ug/ml)組,分別進行膝關節(jié)內注射,5天后用HE染色觀察膝關節(jié)病理學變化。實驗資料采用均數(shù)±標準誤(x±s)表示。

4、所有數(shù)據(jù)運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件采用組內t檢驗、組間F檢驗及相關回歸分析進行差統(tǒng)計學處理,p<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結果：1.創(chuàng)傷后大鼠外周血中細胞色素b含量在4小時達到高峰,后逐漸下降,TNF-α在6小時達到高峰,IL-10、IL-6于10小時達到高峰,后逐漸下降;細胞色素b與炎癥反應呈正相關性。2.對照組和低、中濃度Cyt-b組三種炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6表達沒有明顯變化趨勢,高濃度Cyt-

5、b組和mtDNA組炎癥因子表達隨時間變化增加。高濃度Cyt-b可活化大鼠巨噬細胞釋放炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6。3.關節(jié)內注射高濃度Cyt-b和mtDNA組的大鼠膝關節(jié)病理學表現(xiàn)為明顯炎癥細胞浸潤、滑膜增厚,關節(jié)炎發(fā)生率和嚴重程度均高于對照組。
　　結論：Cyt-b和創(chuàng)傷后炎癥反應呈正相關,高濃度Cyt-b和mtDNA均能通過刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子,并在體外導致炎癥反應的發(fā)生。
　　第二部分，目的：創(chuàng)傷后機體失

6、控性炎癥反應綜合征已成為全球青壯年的首要死亡原因。線粒體DNA編碼的蛋白質,在結構和功能上與細菌類似,其特異結構N-甲酰甲硫氨酸會被FPR-1或FPRL-1識別為外源性物質并啟動機體固有免疫系統(tǒng),可激活機體固有免疫產(chǎn)生炎癥因子,導致無菌性炎癥發(fā)生。本文主要檢測嚴重創(chuàng)傷大鼠外周血中Cyt-b和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6不同時間表達變化,觀察Cyt-b含量與損傷程度的關系。
　　方法：采用動物實驗研究:制備雙側股骨干骨折創(chuàng)

7、傷大鼠模型(n=27),分別在第1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時通過頸動脈置管抽取血液樣本,用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)觀測外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表達,采用SPSS17.0SPSS17.0統(tǒng)計軟件采用回歸與相關分析。
　　結果：創(chuàng)傷后大鼠血液中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的含量均呈現(xiàn)出高峰并在隨后呈現(xiàn)逐步下降趨勢,Cyt-b的峰值出現(xiàn)在

8、約創(chuàng)傷后第4小時,TNF-α在6小時達到高峰,IL-1、IL-6于10小時達到高峰。
　　結論：細胞色素b與炎癥反應程度呈正相關性:外周血Cyt-b濃度越高,炎癥因子濃度越高。
　　第三部分，目的：創(chuàng)傷后全身炎癥反應綜合征是創(chuàng)傷及燒傷后嚴重并發(fā)癥,微生物感染不是導致創(chuàng)傷后SIRS的唯一致病因素。細菌蛋白質含N-甲酰甲硫氨酸,該結構會被FPR-1或FPRL-1識別為外源性物質并激活機體固有免疫系統(tǒng)。線粒體DNA編碼蛋白質之一細

9、胞色素b,和細菌蛋白質具有相同的N-甲酰甲硫氨酸結構,因此假設Cyt-b也應該像細菌蛋白質一樣能通過FPR-1或FPRL-1受體激活固有免疫系統(tǒng)。本研究擬通過體外實驗研究,驗證Cyt-b能否通激活巨噬細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。
　　方法：采用體外實驗研究:SD大鼠腹腔提取巨噬細胞,純化后置入培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分為5組:對照組;mtDNA(10ug/ml)組;Cyt-b(0.1ug/ml)組;Cyt-b(1ug

10、/ml)組;Cyt-b(10ug/ml)組分別加入哦0.2ml的RPMI1640,10ug/ml的mtDNA,0.1ug/ml的Cyt-b,1ug/ml的Cyt-b及10ug/ml的Cyt-b,在0小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時和36小時,用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)觀測外周血中TNF-α、IL-10、IL-6、的表達水平;
　　結果：對照組和低、中濃度Cyt-b組三種炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6

11、表達沒有明顯變化趨勢,與對照組無統(tǒng)計學差異;高濃度Cyt-b(10ug/ml)組和mtDNA(10ug/ml)組炎癥因子表達隨時間變化增加,與對照組比較統(tǒng)計學差異明顯,P<0.01,高濃度Cyt-b組和mtDNA組間無統(tǒng)計學差異。
　　結論：高濃度Cyt-b可活化大鼠巨噬細胞釋放炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6
　　第四部分，目的：第一、二部分實驗證實細胞色素b與創(chuàng)傷后炎癥反應有關,Cyt-b可在體外激活巨噬細胞產(chǎn)生炎

12、癥因子IL-1和IL-6和TNF-α,但Cyt-b能否體內與機體細胞相應受體結合,啟動無菌性炎癥仍然未知,為此本部分采用動物體內實驗研究,觀察注射外源Cyt-b后,能否導致局部炎癥反應。
　　方法：3月齡雄性SD大鼠隨機分為緩沖液組(n=8);mtDNA(10ug/ml)組(n=8);Cyt-b(10ug/ml)組(n=8)共三組。于膝關節(jié)腔內分別注入緩沖液、10ug/ml的mtDNA、10ug/ml的Cyt-b各0.2ml。所有