線粒體DNA編碼蛋白質(zhì)在炎癥反應(yīng)中作用的初步探討.pdf

1、第一部分，目的：創(chuàng)傷導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征,甚至發(fā)生多器官功能衰竭。目前認(rèn)為創(chuàng)傷后大量線粒體破裂,線粒體內(nèi)由其自身DNA編碼合成的蛋白質(zhì)釋放入血,是導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥的重要因素。細(xì)胞色素b是由線粒體DNA編碼合成的一種蛋白質(zhì)。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞色素b和炎癥反應(yīng)相關(guān)性、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞色素b活化巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的檢測(cè)、體外實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射細(xì)胞色素b誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)生三部分,初步探討細(xì)胞色素b在無(wú)菌性炎癥反應(yīng)中所起的作用,為嚴(yán)重

2、創(chuàng)傷后SIRS的發(fā)生、多器官損傷及相關(guān)并發(fā)癥的研究提供新思路。
　　方法：第一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn):制備大鼠雙側(cè)股骨干骨折模型,分別在創(chuàng)傷后第1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測(cè)外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá);第二部分體外實(shí)驗(yàn):將大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為培養(yǎng)基對(duì)照組、mtDNA(10ug/ml)組;Cyt-b(0.1ug/ml)組、Cyt

3、-b(1ug/ml)組、Cyt-b(10ug/ml)組共5組進(jìn)行刺激,分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí),用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6、的表達(dá)水平;第三部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將大鼠分為空白對(duì)照(緩沖液)組、mtDNA(10ug/ml)組、Cyt-b(10ug/ml)組,分別進(jìn)行膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射,5天后用HE染色觀察膝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s)表示。

4、所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件采用組內(nèi)t檢驗(yàn)、組間F檢驗(yàn)及相關(guān)回歸分析進(jìn)行差統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,p<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.創(chuàng)傷后大鼠外周血中細(xì)胞色素b含量在4小時(shí)達(dá)到高峰,后逐漸下降,TNF-α在6小時(shí)達(dá)到高峰,IL-10、IL-6于10小時(shí)達(dá)到高峰,后逐漸下降;細(xì)胞色素b與炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)性。2.對(duì)照組和低、中濃度Cyt-b組三種炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6表達(dá)沒(méi)有明顯變化趨勢(shì),高濃度Cyt-

5、b組和mtDNA組炎癥因子表達(dá)隨時(shí)間變化增加。高濃度Cyt-b可活化大鼠巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6。3.關(guān)節(jié)內(nèi)注射高濃度Cyt-b和mtDNA組的大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)表現(xiàn)為明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增厚,關(guān)節(jié)炎發(fā)生率和嚴(yán)重程度均高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：Cyt-b和創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)呈正相關(guān),高濃度Cyt-b和mtDNA均能通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,并在體外導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　第二部分，目的：創(chuàng)傷后機(jī)體失

6、控性炎癥反應(yīng)綜合征已成為全球青壯年的首要死亡原因。線粒體DNA編碼的蛋白質(zhì),在結(jié)構(gòu)和功能上與細(xì)菌類似,其特異結(jié)構(gòu)N-甲酰甲硫氨酸會(huì)被FPR-1或FPRL-1識(shí)別為外源性物質(zhì)并啟動(dòng)機(jī)體固有免疫系統(tǒng),可激活機(jī)體固有免疫產(chǎn)生炎癥因子,導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥發(fā)生。本文主要檢測(cè)嚴(yán)重創(chuàng)傷大鼠外周血中Cyt-b和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6不同時(shí)間表達(dá)變化,觀察Cyt-b含量與損傷程度的關(guān)系。
　　方法：采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究:制備雙側(cè)股骨干骨折創(chuàng)

7、傷大鼠模型(n=27),分別在第1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)通過(guò)頸動(dòng)脈置管抽取血液樣本,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測(cè)外周血中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá),采用SPSS17.0SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件采用回歸與相關(guān)分析。
　　結(jié)果：創(chuàng)傷后大鼠血液中Cyt-b、TNF-α、IL-1、IL-6的含量均呈現(xiàn)出高峰并在隨后呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì),Cyt-b的峰值出現(xiàn)在

8、約創(chuàng)傷后第4小時(shí),TNF-α在6小時(shí)達(dá)到高峰,IL-1、IL-6于10小時(shí)達(dá)到高峰。
　　結(jié)論：細(xì)胞色素b與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)性:外周血Cyt-b濃度越高,炎癥因子濃度越高。
　　第三部分，目的：創(chuàng)傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征是創(chuàng)傷及燒傷后嚴(yán)重并發(fā)癥,微生物感染不是導(dǎo)致創(chuàng)傷后SIRS的唯一致病因素。細(xì)菌蛋白質(zhì)含N-甲酰甲硫氨酸,該結(jié)構(gòu)會(huì)被FPR-1或FPRL-1識(shí)別為外源性物質(zhì)并激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)。線粒體DNA編碼蛋白質(zhì)之一細(xì)

9、胞色素b,和細(xì)菌蛋白質(zhì)具有相同的N-甲酰甲硫氨酸結(jié)構(gòu),因此假設(shè)Cyt-b也應(yīng)該像細(xì)菌蛋白質(zhì)一樣能通過(guò)FPR-1或FPRL-1受體激活固有免疫系統(tǒng)。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究,驗(yàn)證Cyt-b能否通激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6。
　　方法：采用體外實(shí)驗(yàn)研究:SD大鼠腹腔提取巨噬細(xì)胞,純化后置入培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分為5組:對(duì)照組;mtDNA(10ug/ml)組;Cyt-b(0.1ug/ml)組;Cyt-b(1ug

10、/ml)組;Cyt-b(10ug/ml)組分別加入哦0.2ml的RPMI1640,10ug/ml的mtDNA,0.1ug/ml的Cyt-b,1ug/ml的Cyt-b及10ug/ml的Cyt-b,在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí),用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)觀測(cè)外周血中TNF-α、IL-10、IL-6、的表達(dá)水平;
　　結(jié)果：對(duì)照組和低、中濃度Cyt-b組三種炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6

11、表達(dá)沒(méi)有明顯變化趨勢(shì),與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高濃度Cyt-b(10ug/ml)組和mtDNA(10ug/ml)組炎癥因子表達(dá)隨時(shí)間變化增加,與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯,P<0.01,高濃度Cyt-b組和mtDNA組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：高濃度Cyt-b可活化大鼠巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α,IL-1,IL-6
　　第四部分，目的：第一、二部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞色素b與創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)有關(guān),Cyt-b可在體外激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎

12、癥因子IL-1和IL-6和TNF-α,但Cyt-b能否體內(nèi)與機(jī)體細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合,啟動(dòng)無(wú)菌性炎癥仍然未知,為此本部分采用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,觀察注射外源Cyt-b后,能否導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。
　　方法：3月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為緩沖液組(n=8);mtDNA(10ug/ml)組(n=8);Cyt-b(10ug/ml)組(n=8)共三組。于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注入緩沖液、10ug/ml的mtDNA、10ug/ml的Cyt-b各0.2ml。所有