聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA與EPI的pH敏感長循環(huán)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥納米載體的研究.pdf

1、在腫瘤治療中，內(nèi)源性或獲得性的多藥耐藥是化療過程中的主要障礙，其降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致單種藥物治療腫瘤的效率降低。基因藥物可以抑制細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生，但是遞送過程面臨較多困難，因此選擇合適的載體，將基因與化療藥物聯(lián)合共遞送至腫瘤組織，以發(fā)揮藥效，是治療腫瘤的一個(gè)新策略。本課題制備了一種聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA與表阿霉素（EPI）的pH敏感長循環(huán)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥多功能信封式納米載體（Multifunction

2、Envelop-type Nano Device，MEND）。MEND是以壓縮的DNA、siRNA等為核心，用含有功能性配體的脂質(zhì)體包裹而成的類似信封式外殼的納米微球，兼具了納米粒和脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)。選用聚乙二醇（PEG）連接至磷脂分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）上形成的共聚物DSPE-PEG，實(shí)現(xiàn)長循環(huán)的目的。通過邁克爾加成反應(yīng)，合成具有酸敏感性能的含縮酮鍵的聚β氨基酯結(jié)構(gòu)（KPAE），其通過正負(fù)電結(jié)合作用，縮合siRNA；在細(xì)胞酸

3、性環(huán)境中，KPAE的縮酮建斷裂，實(shí)現(xiàn)siRNA的智能釋放。BCL-2-siRNA通過調(diào)低P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生，協(xié)同表阿霉素起到治療腫瘤的作用。各成分通過核磁共振、凝膠滲透色譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；本實(shí)驗(yàn)選用薄膜分散法制備復(fù)合物載體，EPI包裹在脂質(zhì)體薄膜的磷脂雙分子層疏水端，KPAE/siRNA縮合物溶液水化脂質(zhì)體薄膜后，得到EPI/siRNA-MEND。利用透射電鏡觀察其形態(tài)；馬爾文激光粒度儀測定其

4、粒徑及電位；瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)考察復(fù)合物對(duì)的siRNA縮合能力；分別采用濾膜法-高效液相色譜法和超濾離心法，測定EPI和siRNA的包封率；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選用人肝癌HepG2細(xì)胞，選用BCL-2-siRNA（siBCL-2）制備EPI/siBCL-2-MEND，采用MTT法，考察EPI/siBCL-2-MEND對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響；采用熒光標(biāo)記法，分別用FAM標(biāo)記siRNA，LysoTracker-Blue DND-22標(biāo)記溶酶體

5、，Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核，考察EPI/FAM-siRNA-MEND在肝癌HepG2細(xì)胞的分布以及溶酶體逃逸現(xiàn)象；采用流式細(xì)胞法，考察EPI/FAM-siRNA-MEND對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；用EPI/siBCL-2-MEND，對(duì)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染，考察P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)。采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，考察EPI/Cy5-siRNA-MEND的體內(nèi)分布。結(jié)果表明，成功合成了所需的各目標(biāo)產(chǎn)物；MEND呈規(guī)則的球形且

6、具有明顯的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和指紋結(jié)構(gòu)；EPI/siRNA-MEND平均粒徑為121.6 nm，平均電位為+41.5 mV；載體復(fù)合物對(duì)EPI和siRNA的包封率分別為86.13%和97.07%；MEND在一定給藥劑量范圍內(nèi)毒性較小，對(duì)細(xì)胞存活率幾乎無影響；EPI/siBCL-2-MEND高于同濃度下單獨(dú)藥物的腫瘤細(xì)胞抑制率，并具有較高的轉(zhuǎn)染效率；相比于游離的EPI組和EPI-MEND組，EPI/siBCL-2-MEND 可顯著