NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的研究.pdf

1、多西他賽自臨床應(yīng)用以來，治療腫瘤的效果顯著，上市制劑的臨床應(yīng)用越來越廣泛，但其胃腸道和血液系統(tǒng)毒性、過敏反應(yīng)等毒副作用，影響臨床治療，給患者帶來痛苦。因此通過新型的藥物遞送系統(tǒng)的研究，進(jìn)一步提高藥物的治療指數(shù)，降低毒副作用，是目前相關(guān)研究的熱點之一。在藥物遞送系統(tǒng)的研究中，通過納米材料、生物技術(shù)和物理化學(xué)等理論設(shè)計腫瘤靶向脂質(zhì)體，從而進(jìn)一步提高藥物療效，降低毒副作用，是研究的重要方向。普通脂質(zhì)體由于易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬并清除而難以進(jìn)入腫

2、瘤組織，聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體延長其在血液中的滯留時間，容易透過腫瘤組織的毛細(xì)血管，更有效地在腫瘤部位滲漏和聚集。利用靶向腫瘤本身及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的某些受體的多肽對脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)制劑的靶向性，降低毒副作用。
　　本課題在普通pH敏感脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上，制備被動和主動腫瘤靶向相結(jié)合的NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體:通過聚乙二醇(PEG)修飾達(dá)到長循環(huán)功能，減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬和清除，提高制劑體內(nèi)穩(wěn)定

3、性;采用腫瘤靶向多肽NGR進(jìn)行修飾，使脂質(zhì)體能夠主動靶向至腫瘤部位，提高藥物在腫瘤組織的聚集量;利用琥珀酸膽固醇單酯（CHEMS）的pH敏感機(jī)制靶向釋放藥物，共同實現(xiàn)靶向遞送和控制釋放的功能。本文通過處方篩選制備了多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/PLL)和NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLL)，研究脂質(zhì)體的理化性質(zhì)和體外釋放特性，并考察了脂質(zhì)體的藥物動力學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)外腫瘤靶向性。主要研究方法與結(jié)果如下:

4、
　　1.DTX/PLL的制備與評價
　　采用HPLC測定多西他賽的含量，建立測定脂質(zhì)體包封率的方法。在多西他賽pH敏感脂質(zhì)體處方研究的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)，通過單因素篩選確定脂質(zhì)體中長循環(huán)材料CHEMS-PEG2000的用量。結(jié)果表明長循環(huán)材料的用量為磷脂酰乙醇胺(PE)的5％時包封率最高，包封率為71.88±0.99％，為最優(yōu)處方。按照最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體，并對其進(jìn)行考察，結(jié)果表明所制脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好，粒徑為19

5、2.54±7.73nm，Zeta電勢為-27.9±0.9mV。為研究脂質(zhì)體釋放的pH敏感特性，在不同pH釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放實驗，測定不同制劑的體外釋藥特征。結(jié)果表明與多帕菲(@)相比DTX/PLL在pH7.4介質(zhì)中較穩(wěn)定，72h時累計釋放率達(dá)到81.88％，證明其具有緩釋功能;而在pH5.0介質(zhì)中DTX/PLL釋放加快，48h時累計釋放率為85.50％，證明了其pH敏感的體外釋放特性。
　　2.DTX/NGR-PLL的制備與評

6、價
　　為進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的腫瘤靶向性，通過在脂質(zhì)體表面飾靶向多肽實現(xiàn)腫瘤的主動靶向。設(shè)計合成具有氨肽酶(CD13)受體靶向的多肽NGR的CHEMS-PEG2000-GNGRG聚合物，以脂質(zhì)體包封率、細(xì)胞熒光攝取強(qiáng)度為指標(biāo)，在DTX/PLL的基礎(chǔ)上進(jìn)行處方篩選，確定DTX/NGR-PLL的最優(yōu)處方中靶向材料用量為PE的0.8％;最優(yōu)處方所制脂質(zhì)體脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好，粒徑為202.34±7.40nm，Zeta電勢為-25.7±2.9

7、mV;體外釋放實驗表明，NGR修飾后的脂質(zhì)體DTX/NGR-PLL中藥物釋放行為與未修飾的脂質(zhì)體DTX/PLL相似，DTX/NGR-PLL在pH7.4介質(zhì)中72h時累計釋放率為81.58％，而在pH5.0介質(zhì)中脂質(zhì)體48h時累計釋放率為89.39％，證明其緩釋及pH敏感特性;初步穩(wěn)定性評價實驗中，室溫(25℃)條件下保存3周、低溫4℃冰箱中6周，脂質(zhì)體溶液的外觀性狀、粒徑和EE的變化不大，穩(wěn)定性較好。
　　3.藥物動力學(xué)研究

8、>　　為評價脂質(zhì)體的體內(nèi)長循環(huán)功能，本部分以多帕菲(@)和普通pH敏感脂質(zhì)體(DTX/PSL)作為對照制劑，考察DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特性。DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在各個時間點的血藥濃度較多帕菲(@)和DTX/PSL溶液組明顯提高，AUC0-∞值都顯著增大，DTX/PLL和DTX/NGR-PLL(AUC0-∞=41.521和AUC0-∞=46.430)，較Duopafei(@)（AUC

9、0-∞=12.290）和DTX-PSL(AUC0-∞=28.749)組明顯提高，與普通脂質(zhì)體(DTX/PSL)相比，PEG修飾的兩種長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLL＞DTX/PLL)在大鼠體內(nèi)的滯留時間(MRT)更加延長，MRT0-∞:DTX/NGR-PLL＞DTX/PLL＞DTX/PSL，實驗結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL均可明顯延長藥物的MRT，具有顯著的體內(nèi)長循環(huán)的作用。
　　4.體內(nèi)、外的靶向性研究

10、r>　　通過MCF-7[CD13(-)]和HT-1080細(xì)胞[CD13(+)]考察脂質(zhì)體的體外腫瘤靶向性。MTT法測定的細(xì)胞毒性結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的抗腫瘤活性較游離藥物明顯增強(qiáng)，IC50值均降低，且DTX/NGR-PLL對HT-1080的細(xì)胞毒性較DTX/PLL明顯增強(qiáng);細(xì)胞攝取實驗中兩種細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取較游離溶液明顯增強(qiáng)，兩種細(xì)胞對兩種制劑攝取的不同，驗證了脂質(zhì)體中NGR多肽的靶向作用。熒光探針標(biāo)記的脂質(zhì)

11、體在荷瘤裸鼠腫瘤組織的熒光切片實驗表明，兩種脂質(zhì)體均能成功靶向至腫瘤組織，靶向肽修飾后的靶向效果更明顯，證明DTX/NGR-PLL在體內(nèi)具有較強(qiáng)的腫瘤靶向能力。給藥組小鼠組織、切片表明，DTX/NGR-PLL脂質(zhì)體具有良好的安全性，對主要器官無明顯毒性。
　　本文合成了NGR修飾的靶向材料，通過篩選制備了DTX/PLL和DTX/NGR-PLL，所制脂質(zhì)體外觀良好，粒徑均勻，體外釋放實驗證明了脂質(zhì)體的pH敏感特性，大鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)