同型半胱氨酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致肝脂質(zhì)蓄積作用.pdf

1、背景：
　　同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝途徑的中間代謝產(chǎn)物，高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）與心血管疾病、大腦認(rèn)知障礙、骨質(zhì)疏松和非酒精性脂肪肝密切相關(guān)。HHcy是動脈粥樣硬化的一個獨(dú)立危險因素，近年來有關(guān)此方面的報道已有很多，但Hcy對非酒精性脂肪肝的影響及其分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在采用蛋氨酸負(fù)荷的方法建立高同型半胱氨酸血癥動物模型，結(jié)合原代肝細(xì)胞體外培

2、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以探討Hcy誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　選取4周齡健康雄性C57BL/6J小鼠20只，隨機(jī)分為對照組（Control）和蛋氨酸組（Methionine），每組各10只；在自由進(jìn)食和飲水條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)14天至6周齡時，對照組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，蛋氨酸組小鼠喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加2％蛋氨酸飼料，持續(xù)喂養(yǎng)16周,每周記錄體重；對照組和蛋氨酸組動物在22周齡時處死，稱取肝臟、附睪周圍脂肪重量；收

3、集血液進(jìn)行生化檢測，采用ELISA試劑盒測定血清Hcy水平；采用H&E染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)、脂質(zhì)沉積程度；Real-time PCR檢測肝臟組織目標(biāo)基因表達(dá)水平；Western Blotting檢測肝臟GRP78/BIP、PERK、p-PERK、eIF2ɑ、p-eIF2ɑ和nSREBP1c蛋白表達(dá)水平；原代肝細(xì)胞用高濃度Hcy、Met、PBA和TM處理后進(jìn)行油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)紅染脂質(zhì)數(shù)量；Real-time PCR檢測肝細(xì)胞目標(biāo)基因表達(dá)

4、水平；Western blotting檢測原代肝細(xì)胞GRP78/BIP、PERK、p-PERK、eIF2ɑ、p-eIF2ɑ蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　高蛋氨酸飲食對動物體重增長無顯著影響，但肝臟/體重比值和附睪周圍脂肪/體重比值均顯著高于對照組；肝臟組織切片H.E染色結(jié)果顯示蛋氨酸組小鼠肝組織出現(xiàn)顯著的肝細(xì)胞脂肪變性，血清AST、TG水平顯著增高，HDL水平顯著降低；Real-time PCR結(jié)果顯示蛋氨酸組小鼠肝臟組織

5、CBS的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯下調(diào)；Western blotting結(jié)果提示高蛋氨酸飲食組小鼠肝臟GRP78/BIP、活化的p-PERK、活化的 p-eIF2ɑ和成熟形式的n-SREBP-1c表達(dá)水平增高；油紅O染色結(jié)果表明原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下發(fā)生明顯脂質(zhì)蓄積，PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積明顯減輕；Real-time PCR結(jié)果顯示原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下GRP78、CHOP、

6、FAS、ACC1ɑ和HMG-CoA r的mRNA表達(dá)水平較對照組明顯上調(diào)，PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞GRP78、FAS和ACC1ɑ表達(dá)水平較同型半胱氨酸組明顯下調(diào)，但CHOP和HMG-CoA r表達(dá)水平與同型半胱氨酸組無明顯變化；Western blotting結(jié)果提示原代肝細(xì)胞在同型半胱氨酸和衣霉素作用下GRP78/BIP、p-PERK和p-eIF2ɑ蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，PBA預(yù)處理后再加入同型半胱氨酸干預(yù)肝細(xì)胞上述內(nèi)質(zhì)