miR-200c靶向調(diào)控FUT4調(diào)節(jié)子宮接受態(tài)的建立.pdf

1、背景與目的：
　　1.蛋白質(zhì)巖藻糖基化在子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力方面發(fā)揮重要作用。
　　2.巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ（FUT4）在哺乳動物子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中呈階段特異性表達(dá)，因此被作為評價子宮內(nèi)膜接受態(tài)的一個重要指標(biāo)。
　　3. microRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，miR-200c是miR-200家族的成員之一，在人類生殖過程中發(fā)揮作用。但是，miR-200c與FUT4的關(guān)系以及其在子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立過程中的作

2、用未見報道。
　　4.本研究旨在探討miR-200c對子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立、胚胎著床的影響及其作用機(jī)制，闡述miR-200c對哺乳動物胚胎著床過程的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.通過Real-time PCR，Western blot，ELISA檢測正常未孕、不孕癥、正常早孕、流產(chǎn)患者血清中miR-200c、FUT4的表達(dá)。
　　2. CCK8、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)檢測miR-200c對細(xì)胞增殖及

3、接受胚胎能力的影響。
　　3.雙熒光素酶基因報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FUT4是否是miR-200c的靶基因。
　　4.通過Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)一步研究miR-200c對胚胎著床的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1. PCR、ELISA和Western blot方法檢測結(jié)果顯示：不孕癥患者血清中miR-200c的表達(dá)比正常未孕女性高，流產(chǎn)患者血清中miR-200c的含量比正常早孕女性血清中高，具有顯著性差異（*p<

4、0.05;***p<0.001）。不孕癥患者血清中FUT4的表達(dá)比正常未孕女性低，流產(chǎn)患者血清中FUT4的含量比正常早孕女性血清中低，具有顯著型差異（**p<0.01;***p<0.001）
　　2. miR-200c抑制細(xì)胞增殖和胚胎黏附功能。CCK-8實(shí)驗(yàn)連續(xù)5天記錄細(xì)胞的生長情況。轉(zhuǎn)染miR-200c mimics細(xì)胞組的生長速度顯著慢于對照組細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染Anti-miR-200c后，細(xì)胞的增殖能力顯著高于對照組。平板克隆形

5、成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-200c mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的克隆形成數(shù)低于對照組，而轉(zhuǎn)染Anti-mR-200c細(xì)胞組細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著高于對照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**p<0.01;***p<0.001）。細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics細(xì)胞組的黏附能力顯著低于對照組，轉(zhuǎn)染Anti-miR-200c細(xì)胞組的黏附能力顯著高于對照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p<0.05）。
　　3. FUT4是miR-2

6、00c的靶基因。通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-200c與FUT4存在結(jié)合位點(diǎn)，因此我們構(gòu)建了相應(yīng)熒光素酶載體，同時構(gòu)建了相應(yīng)的突變型載體，與miR-200c mimics共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入RL-95細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細(xì)胞中，F(xiàn)UT4的熒光素酶活性低于對照組（*p<0.05）；轉(zhuǎn)染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細(xì)胞中FUT4的熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染突變型載體組FUT4的熒光素

7、酶活性不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot結(jié)果顯示miR-200c mimics轉(zhuǎn)染后可顯著下調(diào)FUT4的表達(dá)，當(dāng)與FUT4 cDNA共轉(zhuǎn)染后，又可以回調(diào)FUT4的表達(dá)。Anti-miR-200c轉(zhuǎn)染后可顯著上調(diào)FUT4的表達(dá)，當(dāng)與FUT4 siRNA共轉(zhuǎn)染后可回調(diào)FUT4的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色得到了相同的結(jié)果，miR-200c可下調(diào)FUT4的表達(dá)。
　　4. miR-200c通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激

8、活影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的功能。轉(zhuǎn)染miR-200c可抑制p-GSK3β、β-catenin的表達(dá)，其結(jié)果與使用Wnt/β-catenin通路抑制劑DKK的效果一致，當(dāng)與FUT4 cDNA共轉(zhuǎn)染后可重新激活p-GSK3β、β-catenin的表達(dá)。當(dāng)Anti-miR-200c抑制miR-200c的表達(dá)后可激活p-GSK3β、β-catenin的表達(dá)，與FUT4 siRNA共轉(zhuǎn)染后可重新抑制p-GSK3β、β-catenin的表達(dá)。