MIR-370通過靶向ENG調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞增殖和對cDDP敏感性機(jī)制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌作為致命的婦科惡性腫瘤，造成每年在全世界范圍內(nèi)大約12.5萬人死亡，近年來，卵巢癌的起始和進(jìn)展包括在卵巢癌細(xì)胞中異?；蚴д{(diào)的基因的分子機(jī)制研究正在深入進(jìn)行。越來越多證據(jù)表明微RNA（miRNAs）與卵巢癌的惡性增殖程度相關(guān)，本論文發(fā)現(xiàn)miR-370在子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞中失調(diào)，從其宮內(nèi)作用和其作用靶基因預(yù)測驗(yàn)證兩個(gè)方面對其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探究，進(jìn)一步提供新的針對這種惡性腫瘤治療的策略的線索。
　　方法：本論文首先利

2、用qRT-PCR和Northern Blotting實(shí)驗(yàn)檢測子宮內(nèi)膜樣卵巢癌組織和細(xì)胞中的miR-370的異常表達(dá)，然后進(jìn)行功能試驗(yàn)檢測miR-370對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌的影響，利用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測miR-370對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞系IGROV1和TOV112D增殖能力的影響，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-370對兩株子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞系IGROV1和TOV112D遷移能力的影響，利用流氏細(xì)胞儀檢測miR-37

3、0對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，又利用Annexin V/PI雙染色法檢測miR-370對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響。
　　接下來本論文利用生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda對miR-370作用的功能靶基因進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測到ENG基因是miR-370的靶標(biāo)，接著首先本論文構(gòu)建含有ENG基因3’UTR-wt的質(zhì)粒，又利用雙熒光素報(bào)告基因?qū)iR-370作用的直接靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　又進(jìn)一步采

4、用Western Blotting和免疫組織化學(xué)的方法檢測miR-370與ENG蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-370作用靶基因的方式及負(fù)相關(guān)性，文獻(xiàn)表明 ENG蛋白與藥物的耐藥性相關(guān)，計(jì)算 miR-370對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的IC50值，觀察miR-370對藥物耐藥性的影響。
　　最后又進(jìn)行細(xì)胞水平的營救實(shí)驗(yàn)證實(shí) miR-370調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的是通過靶向作用 ENG基因?qū)崿F(xiàn)的，本論文又構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) mi

5、R-370的IGROV1/miR-370細(xì)胞株，進(jìn)行動(dòng)物異體腫瘤移植模型，在體內(nèi)水平同時(shí)證實(shí)了miR-370可以抑制子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的增殖，以及miR-370對化療藥物cDDP的敏感性的影響。
　　結(jié)果：首先，與正常卵巢上皮細(xì)胞相比，miR-370在子宮內(nèi)膜樣卵巢癌組織或細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，表明miR-370可能在惡性腫瘤中具有潛在的腫瘤抑制基因的作用。功能實(shí)驗(yàn)表明miR-370在子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞系IGROV1和TOV112

6、D中可以抑制細(xì)胞的增殖和細(xì)胞克隆形成，同時(shí)也能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
　　第二，MIR-370和 ENG在子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-370可以直接靶向降低ENG蛋白的表達(dá)，，過度表達(dá)miR-370的子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞可使這些細(xì)胞對化療藥物順鉑更加敏感，進(jìn)一步突出了miR-370的潛在的抗腫瘤作用。然而，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)另一種化療劑紫杉醇處理，miR-370并不影響其對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的敏感性。
　　第三，細(xì)胞

7、水平的營救實(shí)驗(yàn)表明miR-370對子宮內(nèi)膜樣卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制和克隆形成能力的影響是通過影響ENG蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。接下來的在體內(nèi)動(dòng)物異體腫瘤移植模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由過表達(dá) miR-370的卵巢癌細(xì)胞 IGROV1成長起來的異體移植的腫瘤與對照組的腫瘤相比有一個(gè)更低的增長率。
　　這些有趣的結(jié)果引起了本論文去尋找鑒定miR-370的功能靶基因以及對miR-370和它的靶基因在上皮性卵巢癌的調(diào)控機(jī)制的研究。
　　結(jié)論: