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文檔簡介
1、背景:乳腺癌是引起女性死亡的主要原因之一。紫杉醇(Paclitaxel)是臨床轉(zhuǎn)移性和侵襲性乳腺癌一線化療藥物,但其耐受性限制其臨床應用。研究發(fā)現(xiàn),化療耐藥性的產(chǎn)生與細胞EMT(epithelial-mesenchymal transition,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變)過程具有一定的相關性,針對EMT誘導機制的研究利于乳腺癌臨床輔助化療方案的制定。microRNAs(miRNA)是乳腺的發(fā)育和乳腺癌發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中控制基因表達的主要調(diào)控
2、因子,越來越多的證據(jù)顯示在乳腺癌化療介導的EMT過程中扮演著重要角色,可通過抑制EMT誘導物控制細胞的可塑性,或通過抑制介導細胞上皮以及間質(zhì)形態(tài)的靶基因來影響細胞的形態(tài)。
目的:研究miR-125b對人乳腺癌MCF-7、SKBR-3紫杉醇耐藥細胞株(下面簡稱“MCF-7/PR”和“SKBR3/PR”)EMT過程的調(diào)控作用及機制。
方法:⑴ qRT-PCR檢測miR-125b在24對乳腺癌標本及其對應的癌旁標本的表達以
3、及在乳腺癌親本細胞株MCF-7,SKBR-3和對應的人乳腺癌MCF-7、SKBR3紫杉醇耐藥細胞株 MCF-7/PR”和“SKBR-3/PR的表達情況;⑵利用化學合成的miR-125b類似物轉(zhuǎn)染 MCF-7/PR、SKBR-3/PR細胞,通過傷口愈合實驗(Wound-healing assay)、細胞侵襲實驗(Transwell assay)、細胞黏附與分離實驗(Attachment and detachment assay)檢測轉(zhuǎn)染后
4、細胞的生物學活性的改變,倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后MCF-7/PR、SKBR-3/PR細胞的形態(tài)學改變;⑶利用qRT-PCR和Western blotting技術檢測miR-125b類似物轉(zhuǎn)染MCF-7/PR、SKBR-3/PR細胞后EMT相關指標E-cadherin、Snail、Slug、Vimentin在分子水平和蛋白水平上的改變;⑷利用生物信息學技術預測miR-125b的靶基因,并通過熒光素酶實驗、qRT-PCR和Western blo
5、tting技術驗證;⑸免疫組化實驗檢測SEMAC在乳腺癌組織中的表達情況;⑹采用Fisher確切概率法分析乳腺癌中miR-125b及其靶基因 SEMA4C的表達與患者病理特征間的相關性;⑺利用 RNA干擾技術下調(diào)SEMA4C的表達,通過劃痕實驗、趨化實驗、粘附分離實驗,分析SEMA4C對MCF-7/PR、SKBR-3/PR細胞生物學活性影響;⑻利用 qRT-PCR和 Western blotting技術檢測SEMA4C干擾后EMT相關標
6、志物的表達改變;⑼SRB實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-125b類似物和SEMA4C干擾后MCF-7/PR、SKBR-3/PR細胞對紫杉醇的藥物敏感性變化。
結(jié)果:⑴ miR-125b在乳腺癌組織中的表達明顯低于對應的癌旁組織,相應的在人乳腺癌紫杉醇耐藥細胞株的表達低于其對應的親本細胞株;⑵轉(zhuǎn)染miR-125b類似物后耐藥細胞株的黏附分離能力、遷移能力和趨化能力明顯低于對照組(P<0.05),鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的耐藥細胞由瘦長的成纖維樣細
7、胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇唸A的上皮樣細胞形態(tài);⑶轉(zhuǎn)染miR-125b類似物后耐藥細胞株上皮細胞相關標志E-cadherin明顯升高(P<0.05);間質(zhì)細胞相關標志如Slug、Snail、Vimentin(P<0.05)明顯下降;⑷生物信息學分析表明SEMA4C是miR-125b的潛在靶基因之一,熒光素酶實驗、qRT-PCR和Western blotting技術進一步證實;⑸免疫組化實驗證實SEMA4C在乳腺癌組織中高表達,miR-125b的表
8、達與SEMA4C負相關,臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)兩者與cerbB-2表達及乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移成負相關;⑹SEMA4C siRNA能夠有效地下調(diào)耐藥細胞株中SEMA4C的表達,并抑制耐藥細胞的遷移侵襲和黏附分離能力(P<0.05);⑺SEMA4C干擾后E-cadherin的表達上調(diào)(P<0.05),Slug、Snail和Vimentin的表達下調(diào)(P<0.05),(P<0.01);⑻轉(zhuǎn)染miR-125b類似物或干擾SEMA4C表達提高MCF-7/
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