miR-125b靶向SEMA4C調(diào)控乳腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞EMT研究.pdf

1、背景：乳腺癌是引起女性死亡的主要原因之一。紫杉醇（Paclitaxel）是臨床轉(zhuǎn)移性和侵襲性乳腺癌一線化療藥物，但其耐受性限制其臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，化療耐藥性的產(chǎn)生與細(xì)胞EMT（epithelial-mesenchymal transition,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變）過(guò)程具有一定的相關(guān)性，針對(duì)EMT誘導(dǎo)機(jī)制的研究利于乳腺癌臨床輔助化療方案的制定。microRNAs(miRNA)是乳腺的發(fā)育和乳腺癌發(fā)生發(fā)展等生理病理過(guò)程中控制基因表達(dá)的主要調(diào)控

2、因子，越來(lái)越多的證據(jù)顯示在乳腺癌化療介導(dǎo)的EMT過(guò)程中扮演著重要角色，可通過(guò)抑制EMT誘導(dǎo)物控制細(xì)胞的可塑性，或通過(guò)抑制介導(dǎo)細(xì)胞上皮以及間質(zhì)形態(tài)的靶基因來(lái)影響細(xì)胞的形態(tài)。
　　目的：研究miR-125b對(duì)人乳腺癌MCF-7、SKBR-3紫杉醇耐藥細(xì)胞株(下面簡(jiǎn)稱“MCF-7/PR”和“SKBR3/PR”)EMT過(guò)程的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　方法：⑴ qRT-PCR檢測(cè)miR-125b在24對(duì)乳腺癌標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁標(biāo)本的表達(dá)以

3、及在乳腺癌親本細(xì)胞株MCF-7，SKBR-3和對(duì)應(yīng)的人乳腺癌MCF-7、SKBR3紫杉醇耐藥細(xì)胞株 MCF-7/PR”和“SKBR-3/PR的表達(dá)情況；⑵利用化學(xué)合成的miR-125b類似物轉(zhuǎn)染 MCF-7/PR、SKBR-3/PR細(xì)胞，通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)（Wound-healing assay）、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell assay）、細(xì)胞黏附與分離實(shí)驗(yàn)（Attachment and detachment assay）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后

4、細(xì)胞的生物學(xué)活性的改變，倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后MCF-7/PR、SKBR-3/PR細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；⑶利用qRT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)miR-125b類似物轉(zhuǎn)染MCF-7/PR、SKBR-3/PR細(xì)胞后EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、Snail、Slug、Vimentin在分子水平和蛋白水平上的改變；⑷利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-125b的靶基因，并通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和Western blo

5、tting技術(shù)驗(yàn)證；⑸免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SEMAC在乳腺癌組織中的表達(dá)情況；⑹采用Fisher確切概率法分析乳腺癌中miR-125b及其靶基因 SEMA4C的表達(dá)與患者病理特征間的相關(guān)性；⑺利用 RNA干擾技術(shù)下調(diào)SEMA4C的表達(dá)，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)、粘附分離實(shí)驗(yàn)，分析SEMA4C對(duì)MCF-7/PR、SKBR-3/PR細(xì)胞生物學(xué)活性影響；⑻利用 qRT-PCR和 Western blotting技術(shù)檢測(cè)SEMA4C干擾后EMT相關(guān)標(biāo)

6、志物的表達(dá)改變；⑼SRB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-125b類似物和SEMA4C干擾后MCF-7/PR、SKBR-3/PR細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性變化。
　　結(jié)果：⑴ miR-125b在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，相應(yīng)的在人乳腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的表達(dá)低于其對(duì)應(yīng)的親本細(xì)胞株；⑵轉(zhuǎn)染miR-125b類似物后耐藥細(xì)胞株的黏附分離能力、遷移能力和趨化能力明顯低于對(duì)照組（P<0.05），鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的耐藥細(xì)胞由瘦長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)

7、胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇唸A的上皮樣細(xì)胞形態(tài)；⑶轉(zhuǎn)染miR-125b類似物后耐藥細(xì)胞株上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志E-cadherin明顯升高（P<0.05）；間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志如Slug、Snail、Vimentin（P<0.05）明顯下降；⑷生物信息學(xué)分析表明SEMA4C是miR-125b的潛在靶基因之一，熒光素酶實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和Western blotting技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)；⑸免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)SEMA4C在乳腺癌組織中高表達(dá)，miR-125b的表

8、達(dá)與SEMA4C負(fù)相關(guān)，臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)兩者與cerbB-2表達(dá)及乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)；⑹SEMA4C siRNA能夠有效地下調(diào)耐藥細(xì)胞株中SEMA4C的表達(dá)，并抑制耐藥細(xì)胞的遷移侵襲和黏附分離能力（P<0.05）；⑺SEMA4C干擾后E-cadherin的表達(dá)上調(diào)（P<0.05），Slug、Snail和Vimentin的表達(dá)下調(diào)（P<0.05），（P<0.01）；⑻轉(zhuǎn)染miR-125b類似物或干擾SEMA4C表達(dá)提高M(jìn)CF-7/