冠心Ⅱ號(hào)主要吸收成分羥基紅花黃色素A抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理及相對(duì)貢獻(xiàn)度研究.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的動(dòng)脈血管壁的慢性炎癥性疾病，是冠心病、心肌梗死、高血壓等心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)。冠心Ⅱ號(hào)由已故的著名中醫(yī)學(xué)家郭士魁先生所創(chuàng)制，方含丹參、川芎、赤芍、紅花和降香五味中藥（比例2∶1∶1∶1∶1），是治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)方。中醫(yī)方劑的療效作用是中藥中多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?①運(yùn)用超高效液相色譜(UPLC)法測(cè)定冠心Ⅱ號(hào)中有效成分的含量，定

2、量分析阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種成分;②建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法定量定性分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號(hào)血漿中3種主要吸收成分阿魏酸、羥基紅花黃色素A和丹參素;③選用ApoE-/-小鼠并給予高脂飲食飼養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，從氧化應(yīng)激機(jī)制角度，研究冠心Ⅱ號(hào)主要吸收成分羥基紅花黃色素A抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理及相對(duì)貢獻(xiàn)度。
　　方法:
　　①超高效液相色譜(UPLC)法

3、測(cè)定冠心Ⅱ號(hào)中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種有效成分的含量。色譜條件:流動(dòng)相:甲醇(A)和1％乙酸水(B);梯度洗脫;0min97％B;1min97％B;6min85％B;11min80％B;15min55％B。
　　②超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對(duì)C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號(hào)血漿主要吸收成分的定性定量分析。色譜條件:流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1％甲酸(B);梯度洗脫:0min90％

4、B;5min40％B;6min10％B;7min10％B;8min90％B。質(zhì)譜條件:離子源:ESI(電噴霧電離，electrospray ionization);檢測(cè)方式:正離子模式;掃描方式:MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，multiple-reaetion monitoring);定量分析時(shí)的離子反應(yīng)分別為m/z192.8-m/z133.96(阿魏酸)、m/z611-m/z491.04(羥基紅花黃色素A)和m/z196.8-m/z178.96

5、(丹參素)。
　　③選定主要吸收成分羥基紅花黃色素A，與母方冠心Ⅱ號(hào)對(duì)ApoE-/-小鼠抗動(dòng)脈粥樣硬化的療效進(jìn)行比較并明確機(jī)理，運(yùn)用公式(相對(duì)貢獻(xiàn)度=成分療效÷母方療效×100％)，初步定量主要吸收成分羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)抗動(dòng)脈粥樣硬化的相對(duì)貢獻(xiàn)度。在本課題研究中，以As模型組為參照，成分療效是指與As模型組比較，給予羥基紅花黃色素A干預(yù)后，各種藥效指標(biāo)含量或表達(dá)水平上升或下降的變化差值;母方療效是指與As模型組比較，給予冠

6、心Ⅱ號(hào)干預(yù)后，各種藥效指標(biāo)含量或表達(dá)水平上升或下降的變化差值，二者變化差值的比值即為羥基紅花黃色素A的相對(duì)貢獻(xiàn)度。選用ApoE-/-小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)8周建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，行血脂[甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]水平檢測(cè)、主動(dòng)脈弓HE染色和油紅O染色以及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)含量測(cè)定;Real T

7、ime Q-PCR檢測(cè)胸腹主動(dòng)脈腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管細(xì)胞黏附因子-1(VCAM-1)、白介素-1β(IL-1β) mRNA水平;Western Blot檢測(cè)胸腹主動(dòng)脈TNF-α、VCAM-1、IL-1β表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　①UPLC法測(cè)定冠心Ⅱ號(hào)湯劑中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、原兒茶醛和芍藥苷5種有效成分的含量。15min內(nèi)5種成分良好分離，色譜峰單一且無(wú)雜峰干擾。線性回歸、精確度、準(zhǔn)確度、回收率

8、、重現(xiàn)性和樣本穩(wěn)定性均良好。5種有效成分含量分別為:阿魏酸128.84±0.47(ng/mg·生藥)、羥基紅花黃色素 A1949.61±1.56(ng/mg·生藥)、丹參素270.38±1.95(ng/mg·生藥)、原兒茶醛184.84±0.80(ng/mg·生藥)、芍藥苷389.67±0.91(ng/mg·生藥)。
　?、赨PLC-MS/MS法對(duì)C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號(hào)血漿3種主要吸收成分的定量定性分析，結(jié)果提示阿魏酸、

9、羥基紅花黃色素A、丹參素均可在血漿中檢測(cè)到，含量分別為:20.4ng/ml、154.0ng/ml和6.9ng/ml，其中羥基紅花黃色素A含量最高。
　?、圻x用ApoE-/-小鼠予以高脂飲食飼養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果提示:a）.血清血脂水平檢測(cè):與正常對(duì)照組相比，模型組TC、HDL-C、LDL-C水平增高，但TG沒(méi)有差異。冠心Ⅱ號(hào)和羥基紅花黃色素A干預(yù)后TC、HDL-C、LDL-C水平下降，其中羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)降低血脂

10、TC、HDL-C、LDL-C水平的相對(duì)貢獻(xiàn)度分別為:46.42％、64.09％、53.89％; b).HE染色鏡下可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成，油紅O染色可見(jiàn)脂質(zhì)及斑塊呈紅色。斑塊面積分析，模型組為(43.25±3.70)％，冠心Ⅱ號(hào)組為(30.20±1.48)％，羥基紅花黃色素A組為(35.63±2.06)％。羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)減少斑塊面積的相對(duì)貢獻(xiàn)度為58.39％;c）.血清MDA、SOD、GSH、CAT含量測(cè)定:與正常對(duì)照組相比，

11、模型組MDA含量增加，SOD、GSH、CAT水平下降;冠心Ⅱ號(hào)和羥基紅花黃色素A干預(yù)后MDA含量減少;SOD、GSH、CAT水平升高。羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)降低MDA含量和升高CAT、SOD、GSH水平的相對(duì)貢獻(xiàn)度分別為:55.79％、56.00％、32.61％、28.34％; d).Real Time Q-PCR檢測(cè)胸腹主動(dòng)脈TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA水平:與正常對(duì)照組相比，模型組TNF-α、VCAM-1和IL

12、-1β mRNA表達(dá)水平升高;冠心Ⅱ號(hào)和羥基;花黃色素A干預(yù)后TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA表達(dá)水平下降;羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA表達(dá)水平的相對(duì)貢獻(xiàn)度分別為:81.83％、85.96％和82.67％;e).Western Blot檢測(cè)胸腹主動(dòng)脈TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達(dá):與正常對(duì)照組相比，模型組TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達(dá)升高;冠心Ⅱ號(hào)和羥基紅花

13、黃色素A干預(yù)后TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達(dá)下降;羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達(dá)的相對(duì)貢獻(xiàn)度分別為:58.88％、61.83％和52.17％。
　　結(jié)論:
　?、龠\(yùn)用超高效液相色譜(UPLC)方法對(duì)冠心Ⅱ號(hào)湯劑中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種有效成分的含量測(cè)定，該方法快速靈敏、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定且重復(fù)性好。
　?、诓捎贸咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(UPL

14、C-MS/MS)法定性定量分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號(hào)血漿中3種主要吸收成分為阿魏酸、羥基紅花黃色素A和丹參素，其中羥基紅花黃色素A含量最高。為研究羥基紅花黃色素A對(duì)冠心Ⅱ號(hào)抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理及相對(duì)貢獻(xiàn)度奠定了基礎(chǔ)。
　?、跘poE-/-小鼠經(jīng)過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)8周后，形成了典型的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變。冠心Ⅱ號(hào)和羥基紅花黃色素A灌胃后，可以改善As病變小鼠血脂水平及斑塊進(jìn)展程度。
　?、蹵s病變小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)