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文檔簡介
1、本文在使用不同濃度BMP4細(xì)胞因子及其拮抗劑-Noggin誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的基礎(chǔ)上,利用啟動子活體熒光標(biāo)記技術(shù),動態(tài)地顯示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb,OB)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化過程中的表達(dá),同時使用Nestin增強子、酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)和GFAP啟動子活體標(biāo)記動態(tài)地顯示SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程,結(jié)合原位雜交結(jié)果,探討B(tài)MP4在SVZa神經(jīng)干
2、細(xì)胞增殖和分化過程中的作用。同時通過Mash1啟動子活性分析探討B(tài)MP4與Mash1轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系。主要結(jié)果如下: 1.原位雜交顯示BMP4mRNA在新生小鼠的表達(dá)在SVZa到嗅球的遷移通路上,BMP4mRNA高表達(dá)于嗅球的周邊細(xì)胞,而在嗅球的中心區(qū)表達(dá)較低。在SVZa區(qū)域,BMP4mRNA為中等量表達(dá),細(xì)胞呈散在分布,在包繞SVZa的星形膠質(zhì)細(xì)胞鞘中表達(dá)增高。在RMS中,BMP4mRNA的表達(dá)較為低下,僅見到極個別陽性細(xì)胞。此
3、外,BMP4mRNA在與SVZa相鄰的SVZp具有相當(dāng)高的的表達(dá)。以上結(jié)果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育不同部位發(fā)揮不同的生理作用。 2.BMP4啟動子活性分析SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染pDsRed-Bmp4pro質(zhì)粒,貼壁分化12小時后見到極少量紅色熒光細(xì)胞。24-48小時后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)孔中陽性細(xì)胞明顯增多,熒光蛋白表達(dá)高峰期在48小時,48小時后減弱,5天后基本消失,早期(48小時內(nèi))紅色熒光蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)
4、胞,晚期則主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。 SVZa、RMS和OB祖細(xì)胞分化過程中的熒光蛋白表達(dá)過程與SVZa神經(jīng)干細(xì)胞相類似,但OB的陽性細(xì)胞明顯較SVZa增多,且始終主要在神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)表達(dá),而RMS的陽性細(xì)胞較少。熒光分光光度計檢測顯示熒光強度由高到低依次為OB、SVZa和RMS。以上結(jié)果表明BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化的不同部位和不同時期存在差異表達(dá),提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的不同時期、不同部位發(fā)揮不同的生
5、理作用。 3.BMP4對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示在1、2、5ng/ml濃度時,BMP4促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,以2ng/ml濃度最明顯;10、20、50、100ng/ml濃度時,BMP4抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,濃度越高,抑制作用越明顯。流式細(xì)胞儀周期分析結(jié)果表明,在1-5ng/ml濃度時,靜止期細(xì)胞減少,DNA合成期細(xì)胞增加,仍以2ng/ml濃度明顯;10-100ng/ml濃度時,靜止期細(xì)胞大量增加,分裂期和S期
6、細(xì)胞銳減。以上結(jié)果提示不同濃度的BMP4通過對細(xì)胞周期的調(diào)控影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,低濃度BMP4促進(jìn)增殖,而高濃度BMP4則抑制其增殖。 4.BMP4對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響加入不同濃度的BMP4,2天時行MAP-2和NSE免疫熒光染色,結(jié)果顯示NSE陽性細(xì)胞均增多,流式細(xì)胞儀檢測SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化結(jié)果表明,1-100ng/ml濃度BMP4在2天時均可促進(jìn)SVZa向神經(jīng)元分化,1-10ng/ml時逐漸增加,10
7、-100ng時處于一平臺;在7天時行NSE免疫熒光染色,結(jié)果顯示NSE陽性細(xì)胞均有所減少,流式細(xì)胞儀檢測也得到相似的結(jié)果。加入10ng/ml濃度的BMP4,在不同時相點顯示神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化,結(jié)果表明,BMP4在分化早期使神經(jīng)元比例增高,2天時達(dá)到高峰,4天時與對照組持平,此后下降。以上結(jié)果提示BMP4對體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞具有雙重作用,在干細(xì)胞分化的早期增加神經(jīng)元分化比例,晚期則抑制神經(jīng)元的分化。 5.Noggi
8、n對BMP4的拮抗作用轉(zhuǎn)染PEGFP-Noggin質(zhì)粒后加入不同濃度的BMP4,行NSE免疫熒光染色,結(jié)果顯示Noggin能拮抗BMP4的作用,在早期使神經(jīng)元數(shù)目減少,在晚期使神經(jīng)元數(shù)目增多。流式細(xì)胞儀檢測證實了免疫熒光染色結(jié)果。以上結(jié)果提示Noggin可佶抗BMP4的作用,在分化早期抑制神經(jīng)元的分化,晚期促進(jìn)神經(jīng)元的分化。 6.BMP4影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的活體熒光標(biāo)記SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Nestin-GFP質(zhì)粒,貼壁
9、分化8小時后即出現(xiàn)較多陽性細(xì)胞,24小時后達(dá)到高峰,此后減弱。加入10ng/mlBMP4后,陽性細(xì)胞大幅減少,在24-48小時內(nèi)與對照組比較尤為明顯,此后差異逐漸減小。熒光分光光度計定量檢測結(jié)果顯示,加入BMP4后1-3天內(nèi)Nestin增強子活性明顯減弱,而在4-7天內(nèi)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。轉(zhuǎn)染TH-GFP質(zhì)粒8小時后見到個別陽性細(xì)胞,此后逐漸增多,48-72小時達(dá)到高峰。加入10ng/mlBMP4后,TH陽性細(xì)胞有所增加,在24-48
10、小時內(nèi)與對照組比較有明顯差異。熒光分光光度計定量檢測結(jié)果顯示,加入BMP4后在1、2和3天時與對照組存在差異,而在4天后無明顯差異。 SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFAP-GFP質(zhì)粒,貼壁分化8小時后見到陽性細(xì)胞,此后逐漸增多。加入10ng/mlBMP4后,陽性細(xì)胞均有所增加。與Nestin-GFP和TH-GFP標(biāo)記不同的是,GFAP啟動子活性在觀察期內(nèi)持續(xù)增多。熒光分光光度計定量檢測結(jié)果顯示,加入BMP4后GFAP啟動子活性在觀察期
11、內(nèi)(1-7天)持續(xù)增多,均有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果表明在分化的早期,BMP4使神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Nestin)的表達(dá)減少,多巴胺神經(jīng)元(TH)的標(biāo)志物增多,即神經(jīng)前體細(xì)胞減少,而成熟神經(jīng)元增多,而在晚期卻沒有統(tǒng)計學(xué)差異,這顯示BMP4只是加速了神經(jīng)干細(xì)胞和組細(xì)胞的分化,并沒有特異性地誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 7.BMP4對Mash1啟動子活性的影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mash1-LacZ質(zhì)粒,貼壁分化后1天行X-ga
12、l染色即出現(xiàn)一些陽性細(xì)胞,主要在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn),結(jié)合相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大多為神經(jīng)元樣細(xì)胞著色。加入10ng/ml的BMP4,在分化后1-2天內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)有所增加,此后陽性細(xì)胞數(shù)增加不明顯,4天后則有所減少。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明,加入BMP4后在分化的早期增強Mash1啟動子活性,1天和2天時與對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異,在晚期有減弱Mash1啟動子活性的趨勢,但與對照組比較差異不顯著。以上結(jié)果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的早期誘導(dǎo)了Mash
13、1轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生。 通過對以上結(jié)果的綜合分析,結(jié)合參考文獻(xiàn),本研究尚得出以下結(jié)論:1.本研究中采用的啟動子活體熒光標(biāo)記實現(xiàn)了BMP4表達(dá)的活體追蹤,能夠反映正常情況下內(nèi)在蛋白的表達(dá)情況,而且動態(tài)地顯示了神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程,顯示其為一種較好的活體追蹤方法。 2.BMP4啟動子活性分析顯示,在分化的晚期紅色熒光蛋白主要在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測在7天時發(fā)現(xiàn)BMP4抑制神經(jīng)元的分化,而啟動
14、子活性分析顯示BMP4持續(xù)性增加GFAP啟動子活性,因此BMP4本身對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的特異性作用可能仍然為抑制神經(jīng)元的分化,促使其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。 3.在嗅球周邊區(qū)域,原位雜交和啟動子活性分析顯示BMP4為高表達(dá),體外培養(yǎng)顯示高濃度的BMP4抑制干細(xì)胞的增殖,促使其退出細(xì)胞周期而分化,由于在嗅球主要為已定向的神經(jīng)元祖細(xì)胞,因此BMP4在嗅球周邊區(qū)域的主要作用可能是促使祖細(xì)胞退出細(xì)胞周期啟動祖細(xì)胞的分化。 4.在R
15、MS和嗅球中央?yún)^(qū),原位雜交和啟動子活性分析顯示BMP4的表達(dá)量低,而低濃度的BMP4促進(jìn)祖細(xì)胞的增殖,不斷進(jìn)入細(xì)胞周期,因此在此部位,BMP4的作用可能為促進(jìn)其增殖,維持神經(jīng)元祖細(xì)胞狀態(tài)而不使其繼續(xù)分化。5.在SVZa,原位雜交和啟動子活性分析顯示為中等量的表達(dá),因此BMP4在SVZa可能具有更為復(fù)雜的作用,它既可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,還可能具有促進(jìn)干細(xì)胞退出細(xì)胞周期的作用。在SVZp,原位雜交顯示為高豐度的BMP4mRNA
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