BMP4對SVZa神經(jīng)干細胞增殖和分化的調控.pdf

1、本文在使用不同濃度BMP4細胞因子及其拮抗劑-Noggin誘導SVZa神經(jīng)干細胞增殖、分化的基礎上，利用啟動子活體熒光標記技術，動態(tài)地顯示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb，OB)神經(jīng)干細胞和祖細胞分化過程中的表達，同時使用Nestin增強子、酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)和GFAP啟動子活體標記動態(tài)地顯示SVZa神經(jīng)干細胞的分化過程，結合原位雜交結果，探討B(tài)MP4在SVZa神經(jīng)干

2、細胞增殖和分化過程中的作用。同時通過Mash1啟動子活性分析探討B(tài)MP4與Mash1轉錄因子的關系。主要結果如下： 1.原位雜交顯示BMP4mRNA在新生小鼠的表達在SVZa到嗅球的遷移通路上，BMP4mRNA高表達于嗅球的周邊細胞，而在嗅球的中心區(qū)表達較低。在SVZa區(qū)域，BMP4mRNA為中等量表達，細胞呈散在分布，在包繞SVZa的星形膠質細胞鞘中表達增高。在RMS中，BMP4mRNA的表達較為低下，僅見到極個別陽性細胞。此

3、外，BMP4mRNA在與SVZa相鄰的SVZp具有相當高的的表達。以上結果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細胞發(fā)育不同部位發(fā)揮不同的生理作用。 2.BMP4啟動子活性分析SVZa神經(jīng)干細胞轉染pDsRed-Bmp4pro質粒，貼壁分化12小時后見到極少量紅色熒光細胞。24-48小時后SVZ神經(jīng)干細胞培養(yǎng)孔中陽性細胞明顯增多，熒光蛋白表達高峰期在48小時，48小時后減弱，5天后基本消失，早期(48小時內)紅色熒光蛋白主要表達于神經(jīng)元細

4、胞，晚期則主要表達于星形膠質細胞。 SVZa、RMS和OB祖細胞分化過程中的熒光蛋白表達過程與SVZa神經(jīng)干細胞相類似，但OB的陽性細胞明顯較SVZa增多，且始終主要在神經(jīng)元樣細胞內表達，而RMS的陽性細胞較少。熒光分光光度計檢測顯示熒光強度由高到低依次為OB、SVZa和RMS。以上結果表明BMP4在SVZa神經(jīng)干細胞遷移和分化的不同部位和不同時期存在差異表達，提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細胞發(fā)育的不同時期、不同部位發(fā)揮不同的生

5、理作用。 3.BMP4對SVZa神經(jīng)干細胞增殖的影響細胞計數(shù)結果顯示在1、2、5ng/ml濃度時，BMP4促進神經(jīng)干細胞的增殖，以2ng/ml濃度最明顯；10、20、50、100ng/ml濃度時，BMP4抑制神經(jīng)干細胞的增殖，濃度越高，抑制作用越明顯。流式細胞儀周期分析結果表明，在1-5ng/ml濃度時，靜止期細胞減少，DNA合成期細胞增加，仍以2ng/ml濃度明顯；10-100ng/ml濃度時，靜止期細胞大量增加，分裂期和S期

6、細胞銳減。以上結果提示不同濃度的BMP4通過對細胞周期的調控影響SVZa神經(jīng)干細胞的增殖，低濃度BMP4促進增殖，而高濃度BMP4則抑制其增殖。 4.BMP4對SVZa神經(jīng)干細胞分化的影響加入不同濃度的BMP4，2天時行MAP-2和NSE免疫熒光染色，結果顯示NSE陽性細胞均增多，流式細胞儀檢測SVZa神經(jīng)干細胞分化結果表明，1-100ng/ml濃度BMP4在2天時均可促進SVZa向神經(jīng)元分化，1-10ng/ml時逐漸增加，10

7、-100ng時處于一平臺；在7天時行NSE免疫熒光染色，結果顯示NSE陽性細胞均有所減少，流式細胞儀檢測也得到相似的結果。加入10ng/ml濃度的BMP4，在不同時相點顯示神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，結果表明，BMP4在分化早期使神經(jīng)元比例增高，2天時達到高峰，4天時與對照組持平，此后下降。以上結果提示BMP4對體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細胞具有雙重作用，在干細胞分化的早期增加神經(jīng)元分化比例，晚期則抑制神經(jīng)元的分化。 5.Noggi

8、n對BMP4的拮抗作用轉染PEGFP-Noggin質粒后加入不同濃度的BMP4，行NSE免疫熒光染色，結果顯示Noggin能拮抗BMP4的作用，在早期使神經(jīng)元數(shù)目減少，在晚期使神經(jīng)元數(shù)目增多。流式細胞儀檢測證實了免疫熒光染色結果。以上結果提示Noggin可佶抗BMP4的作用，在分化早期抑制神經(jīng)元的分化，晚期促進神經(jīng)元的分化。 6.BMP4影響SVZa神經(jīng)干細胞分化的活體熒光標記SVZa神經(jīng)干細胞轉染Nestin-GFP質粒，貼壁

9、分化8小時后即出現(xiàn)較多陽性細胞，24小時后達到高峰，此后減弱。加入10ng/mlBMP4后，陽性細胞大幅減少，在24-48小時內與對照組比較尤為明顯，此后差異逐漸減小。熒光分光光度計定量檢測結果顯示，加入BMP4后1-3天內Nestin增強子活性明顯減弱，而在4-7天內與對照組無統(tǒng)計學差異。轉染TH-GFP質粒8小時后見到個別陽性細胞，此后逐漸增多，48-72小時達到高峰。加入10ng/mlBMP4后，TH陽性細胞有所增加，在24-48

10、小時內與對照組比較有明顯差異。熒光分光光度計定量檢測結果顯示，加入BMP4后在1、2和3天時與對照組存在差異，而在4天后無明顯差異。 SVZa神經(jīng)干細胞轉染GFAP-GFP質粒，貼壁分化8小時后見到陽性細胞，此后逐漸增多。加入10ng/mlBMP4后，陽性細胞均有所增加。與Nestin-GFP和TH-GFP標記不同的是，GFAP啟動子活性在觀察期內持續(xù)增多。熒光分光光度計定量檢測結果顯示，加入BMP4后GFAP啟動子活性在觀察期

11、內(1-7天)持續(xù)增多，均有統(tǒng)計學差異。以上結果表明在分化的早期，BMP4使神經(jīng)干細胞標志物(Nestin)的表達減少，多巴胺神經(jīng)元(TH)的標志物增多，即神經(jīng)前體細胞減少，而成熟神經(jīng)元增多，而在晚期卻沒有統(tǒng)計學差異，這顯示BMP4只是加速了神經(jīng)干細胞和組細胞的分化，并沒有特異性地誘導SVZa神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。 7.BMP4對Mash1啟動子活性的影響SVZa神經(jīng)干細胞轉染Mash1-LacZ質粒，貼壁分化后1天行X-ga

12、l染色即出現(xiàn)一些陽性細胞，主要在細胞核內出現(xiàn)，結合相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大多為神經(jīng)元樣細胞著色。加入10ng/ml的BMP4，在分化后1-2天內陽性細胞數(shù)有所增加，此后陽性細胞數(shù)增加不明顯，4天后則有所減少。細胞計數(shù)結果表明，加入BMP4后在分化的早期增強Mash1啟動子活性，1天和2天時與對照組存在統(tǒng)計學差異，在晚期有減弱Mash1啟動子活性的趨勢，但與對照組比較差異不顯著。以上結果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細胞分化的早期誘導了Mash

13、1轉錄因子的產(chǎn)生。 通過對以上結果的綜合分析，結合參考文獻，本研究尚得出以下結論：1.本研究中采用的啟動子活體熒光標記實現(xiàn)了BMP4表達的活體追蹤，能夠反映正常情況下內在蛋白的表達情況，而且動態(tài)地顯示了神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質細胞的分化過程，顯示其為一種較好的活體追蹤方法。 2.BMP4啟動子活性分析顯示，在分化的晚期紅色熒光蛋白主要在膠質細胞內表達，流式細胞儀檢測在7天時發(fā)現(xiàn)BMP4抑制神經(jīng)元的分化，而啟動

14、子活性分析顯示BMP4持續(xù)性增加GFAP啟動子活性，因此BMP4本身對SVZa神經(jīng)干細胞的特異性作用可能仍然為抑制神經(jīng)元的分化，促使其向星形膠質細胞分化。 3.在嗅球周邊區(qū)域，原位雜交和啟動子活性分析顯示BMP4為高表達，體外培養(yǎng)顯示高濃度的BMP4抑制干細胞的增殖，促使其退出細胞周期而分化，由于在嗅球主要為已定向的神經(jīng)元祖細胞，因此BMP4在嗅球周邊區(qū)域的主要作用可能是促使祖細胞退出細胞周期啟動祖細胞的分化。 4.在R

15、MS和嗅球中央?yún)^(qū)，原位雜交和啟動子活性分析顯示BMP4的表達量低，而低濃度的BMP4促進祖細胞的增殖，不斷進入細胞周期，因此在此部位，BMP4的作用可能為促進其增殖，維持神經(jīng)元祖細胞狀態(tài)而不使其繼續(xù)分化。5.在SVZa，原位雜交和啟動子活性分析顯示為中等量的表達，因此BMP4在SVZa可能具有更為復雜的作用，它既可促進神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞分化，還可能具有促進干細胞退出細胞周期的作用。在SVZp，原位雜交顯示為高豐度的BMP4mRNA