不同時(shí)期異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肝纖維化的作用.pdf

1、目的：
　　 肝纖維化是多數(shù)終末期肝病發(fā)展的共同階段，這一階段如果得不到有效治療，將會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至導(dǎo)致患者死亡。對(duì)于終末期肝病，原位肝移植(Orthotopic liver transplantation，OLT)理論上是最理想的治療方法，但是供體的缺乏及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)與高額的醫(yī)療費(fèi)用又成了一個(gè)新的問(wèn)題，即使更新的異位肝移植和原位部分肝移植也存在同樣的問(wèn)題，因此必須尋找其他可能的解決辦法。干細(xì)胞在一定條件下可以分化為肝樣

2、細(xì)胞，并補(bǔ)充纖維化過(guò)程中損傷的肝細(xì)胞，從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)和延緩肝纖維化，且不存在免疫排斥，為臨床終末期肝病治療提供了新的思路。
　　 鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenehymal stem cells，BMSCs)和建立肝硬化動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，通過(guò)尾靜脈輸注BMSCs來(lái)?yè)鞙y(cè)其是否可以改善受損肝臟的肝功能，并探索最佳移植時(shí)期，為BMSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：<

3、br>　　 1.體重200～250gSD大鼠60只，設(shè)正常對(duì)照組(n=10)，普食普水；
　　 2.應(yīng)用40％CCl4油溶液0.3ml/100g皮下注射，以10％酒精為唯一飲用水，誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型；
　　 3.取正常健康5周齡大鼠股骨骨髓，貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)MSCs并傳代擴(kuò)增，獲得足夠量的供移植用MSCs懸液；
　　 4.將培養(yǎng)得到的的健康SD大鼠MSC用DAPI標(biāo)記，分別于肝硬化造模的第6周，10周經(jīng)尾靜脈

4、注射1×106MSCs；
　　 5.在移植4周后，評(píng)價(jià)移植組與對(duì)照組的生存狀態(tài)，觀察肝臟的大體改變及肝臟的重量，行肝功能檢測(cè)(ALB.ALT.TBIL.)，取肝臟做病理檢查，熒光顯微鏡下觀察，了解BMSCs在肝內(nèi)的整合情況；
　　 6.收集，記錄數(shù)據(jù)，做出統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功培養(yǎng)出了BMSCs，相差顯微鏡下，新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞透亮度好，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中，第3天換液后，可見(jiàn)少

5、量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，貼壁后細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，貼壁細(xì)胞體積增大，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞梭形外觀；
　　 2.皮下注射40％CCl4油溶液8周后，大鼠精神差，進(jìn)食減少，體重明顯降低(283±19 vs335±16g)，剖腹后可從腹腔抽出5ml左右清亮腹水，肝臟外觀稍腫大(13±1.69 vs10.02±1.06g)，呈不均勻的暗紅色，表面可見(jiàn)大量點(diǎn)狀壞死。生化指標(biāo)與正常對(duì)照組相比：ALT(336.25±6.25 vs37.67±

6、14.35IU/L，P＜0.01)，ALB(23.13±1.56 vs33.13±1.51g/L，P＜0.01)，TBIL(16.14±1.28 vs0.93+0.55μmol/L，P＜0.01)。HE染色示：正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，被假小葉所取代，肝細(xì)胞有不同程度的脂肪浸潤(rùn)、片狀壞死，同時(shí)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；
　　 3.MSCs經(jīng)尾靜脈移植入肝硬化大鼠后，6周移植組，10移植組大鼠肝功能較對(duì)照組均明顯改善，ALT(97±17.35，

7、180±19.68 vs336.25±6.25IU/L，P＜0.01)，ALB(30.81±1.30，28.8±1.82 vs23.13±1.56g/L，P＜0.01)，TBIL(13.42±0.82，14.91±1.18 vs16.14±1.28μmol/L，P＜0.01)，P＜0.05與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中6周移植組較10周移植組效果更佳(F=2.86，P＜0.05)，體重也有所增加(324±17 vs302±21g)。病理

8、檢查結(jié)果示：MSCs6周移植組肝內(nèi)膠原纖維增生程度明顯減輕，盡管假小葉仍然存在，但小葉周?chē)托∪~內(nèi)的膠原纖維明顯減少，10周移植組肝組織部分恢復(fù)，但仍然可見(jiàn)損傷細(xì)胞、出血和炎性浸潤(rùn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法適合大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、細(xì)胞獲得率高等特點(diǎn)，且第三代細(xì)胞仍有很強(qiáng)的增值能力，達(dá)到了移植要求；
　　 2.采用聯(lián)合酒精的四氯化碳復(fù)合法，CCl4與豆油混合成40％的濃度，每周