骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷的實驗研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALl)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床上比較常見的危重病癥，死亡率高達(dá)40％。ALl是ARDS的前期。ALI/ARDS的主要病理改變是彌漫性的肺泡一毛細(xì)血管膜的損傷，可由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒及有害氣體吸入等多種因素引起，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥<'[1]>。除機(jī)械通氣外，目前對ALI/RDS的

2、治療仍缺乏有效的手段。尋找新的治療措施是目前ALI/ARDS研究中的重點(diǎn)。 上世紀(jì)九十年代以來，干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了一系列突破性進(jìn)展，為利用干細(xì)胞修復(fù)組織損傷，治療一些疑難和復(fù)雜疾病提供了可能性。文獻(xiàn)相繼報道了干細(xì)胞在治療心力衰竭、糖尿病等方面的一些進(jìn)展<'[2]>，展示了其作為一種新型治療手段的良好前景。干細(xì)胞是一類具有無限自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞<'[3]>，按發(fā)生學(xué)來源可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem

3、 cell，ESC)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中，在病理狀態(tài)或外因誘導(dǎo)下可以表現(xiàn)出不同程度的再生和更新能力。某些情況下，成體干細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的跨系或跨胚層分化潛能，即具有“可塑性(plasticity)”<[4、5]>。 骨髓(bone marrow)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)屬于成體干細(xì)胞，目前報道它具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)

4、胞、成脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞甚至肝臟細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等方向分化的多種潛能<'[5]>。而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過骨髓吸取就可以得到，取材容易，并在體外有很大的擴(kuò)增潛能<'[7]>，因此利用MSCs治療疾病具有突出的優(yōu)點(diǎn)。 本研究觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，主要進(jìn)行了以下幾方面的工作： 1．小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。取小鼠后

5、肢股骨和脛骨，吸取骨髓進(jìn)行全骨髓培養(yǎng)，得到MSCs，并做細(xì)胞免疫化學(xué)染色，檢測MSCs特異表面標(biāo)記。 2．建立LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型。利用小鼠咽后壁吸入LPS的方法造成小鼠肺損傷；稱重計算肺水腫指數(shù)；肺組織切片HE染色觀察組織病理改變；E LlSA檢測肺泡灌洗液和肺組織勻漿中IL-1β含量。 3．供體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植和效果評價。將供體MSCs用Brdu標(biāo)記后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察細(xì)胞核中Brdu標(biāo)記效果；

6、將標(biāo)記過的MSCs制成細(xì)胞懸液，通過尾靜脈移植入肺損傷小鼠體內(nèi)，移植后4天做肺組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及雙染色觀察移植細(xì)胞的植入和分化狀態(tài)；檢測肺水腫指數(shù)，肺泡灌洗液和肺組織勻漿中l(wèi)L-1β含量。 結(jié)果表明： 1、培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞多呈集落樣生長，體積較小，成梭形或柳葉形，細(xì)胞核明顯，核漿比大。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示，表面標(biāo)記CD44陽性，而造血系表面標(biāo)記CD34陰性。 2、吸入LPS后，小鼠出現(xiàn)典型的肺損

7、傷病理改變，炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，毛細(xì)血管充血，肺泡內(nèi)可見透明膜形成，嚴(yán)重者肺泡正常結(jié)構(gòu)消失。損傷小鼠肺水腫指數(shù)和肺組織勻漿lL-1β含量明顯增加。 3、用Brdu標(biāo)記小鼠MSCs后，利用抗Brdu單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯示標(biāo)記的細(xì)胞出現(xiàn)Brdu陽性；標(biāo)記的MSCs移植入同種異體的小鼠肺損傷模型內(nèi)，小鼠肺部出現(xiàn)外源性MSCs，這些細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞表型，免疫組織化學(xué)雙染色顯示Brdu陽性細(xì)胞也表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物—