胃癌微環(huán)境和膠原重構的特點及膠原受體DDR2對胃癌生長和侵襲的影響.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率列第四位的惡性腫瘤，居腫瘤相關死因的第三位。盡管胃癌的治療在近年來取得了較大進展，患者的預后仍然較差，5年總體生存率僅為29.6％。預后評估在確定胃癌治療方案時具有重要作用，對預后較差的患者宜采用較激進的治療方案，以最大限度地清除腫瘤，延長患者生存期;而對預后較好的患者，治療方式則不宜過于激進，以避免過度治療。在胃癌預后評估方面，目前使用最廣泛的是TNM分期，該指標包含腫瘤侵犯深度（T分期）、淋巴結轉(zhuǎn)移（N分期）和

2、遠處轉(zhuǎn)移（M分期）三個方面，是最重要的預后指標。然而，即使TNM分期完全相同的胃癌患者，其預后也不盡相同，甚至可能存在較大差異。因此，尋找新的胃癌預后指標具有十分重要的意義。
　　以往的胃癌預后指標，包括TNM分期在內(nèi)，多為反映癌細胞生物行為的指標。而腫瘤組織除了由癌細胞構成的實質(zhì)以外，還包含一定量的間質(zhì)成分。腫瘤間質(zhì)形成腫瘤細胞賴以生存的微環(huán)境，對腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有重要影響。因此，反映腫瘤間質(zhì)或微環(huán)境特點的某些指標也

3、可能用于胃癌預后的評估。腫瘤間質(zhì)比率(TSP，tumor stroma percentage)和Klintrup-M(a)kinen分級（KM分級）是近年來受到較多關注的兩個腫瘤微環(huán)境相關的預后指標。其中TSP反映腫瘤間質(zhì)在腫瘤組織中所占的比率（百分比），而KM分級通過衡量腫瘤侵襲前沿炎細胞浸潤數(shù)量來反映腫瘤微環(huán)境內(nèi)炎癥反應的程度，KM分級越高則炎癥反應程度越顯著。既往研究發(fā)現(xiàn)，上述兩個指標可較好地用于對某些腫瘤預后的評估。有學者進一步

4、將TSP和KM分級結合起來，提出了一個新的評估腫瘤微環(huán)境的指標——Glasgow微環(huán)境評分(Glasgow microenvironment score，GMS)。在該評分系統(tǒng)中，高KM分級定義為0分（無論TSP如何），低KM分級/低TSP為1分，低KM/高TSP為2分。研究證實，GMS的預后價值較高，明顯優(yōu)于單一的TSP或KM分級。然而，GMS在胃癌能否成為評估預后有用指標，目前尚不清楚。
　　目的：
　　在本研究中，我們

5、考察了GMS與胃癌患者生存期的關系，提出胃癌存在兩種典型的腫瘤微環(huán)境:炎癥性微環(huán)境和促纖維增生性微環(huán)境。其中，具有炎癥性微環(huán)境的病例預后較好，而促纖維增生性微環(huán)境與胃癌的快速進展密切相關，此類患者預后極差。促纖維增生性微環(huán)境的一個重要特點在于富含大量膠原纖維，而迄今尚不清楚胃癌微環(huán)境中膠原纖維發(fā)生了何種病理改變，膠原纖維對胃癌細胞的生物行為有何影響也缺乏研究。我們進而以膠原纖維為對象，探討了膠原纖維含量與胃癌預后的關系，從質(zhì)和量的角度系

6、統(tǒng)闡述了胃癌組織內(nèi)膠原重構的特征以及膠原纖維的構筑表型，并檢測了膠原對胃癌侵襲和增殖的影響。同時，由于膠原纖維位于細胞外，其對細胞的影響需通過細胞表面的膠原受體發(fā)揮作用，而盤狀結構域受體2(DDR2，discoidin domain receptor2)是一種重要的膠原受體，有關DDR2在胃癌中的作用和意義尚缺乏研究。本課題繼而通過三維立體培養(yǎng)，模擬含Ⅰ型膠原的腫瘤微環(huán)境，初步探討了DDR2對胃癌細胞增殖和侵襲的影響，明確其在胃癌進展中

7、的意義。
　　方法和結果:
　　1.基于組織形態(tài)學觀察評估225例胃癌的GMS，其中32例為GMS0分，111例為GMS1分，82例為GMS2分。GMS0分的患者其5年OS和DFS分別為78.1％和62.5％，顯著高于GMS1分者（5年OS:54.1％;5年DFS:45.9％），而GMS2分的患者預后最差，其5年OS和DFS均為24.4％。采用Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，GMS是胃癌的獨立預后因素。
　　2.免疫組織化學

8、染色顯示，GMS0分的胃癌更易于出現(xiàn)錯配修復基因表達缺失(P=0.042)，癌細胞表達PD-L1的陽性率更高(P=0.030);顯色原位雜交提示，GMS0分的胃癌伴有EB病毒感染的幾率也更高（P=0.037）。
　　3.免疫組織化學染色顯示，GMS2分的胃癌含有更多的腫瘤相關纖維母細胞(P＜0.001);苦味酸-天狼星紅染色和雙光子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GMS2分的胃癌組織內(nèi)膠原纖維更為豐富（P＜0.001），其成熟度也明顯更低。

9、>　　4.對TCGA數(shù)據(jù)庫中155例胃癌評估GMS后，進行mRNA表達譜聚類分析，發(fā)現(xiàn)GMS0分的胃癌有282個基因高表達，其中涉及炎癥相關信號通路的基因最為多見;GMS2分的胃癌有1589個基因高表達，高表達基因主要是涉及細胞-細胞以及細胞-ECM之間相互作用的基因。
　　5.查詢網(wǎng)絡公共數(shù)據(jù)庫(Kaplan-Meier Plotter)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Ⅰ型膠原的mRNA表達水平與胃癌的總體生存密切相關（P＜0.001），表達水

10、平越高患者預后越差。而對225例胃癌Ⅰ型膠原的含量評估后也證實，富含膠原的胃癌5年-OS及5年-DFS率更低(P＜0.001)。體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，增加Ⅰ型膠原濃度可促進胃癌細胞的侵襲;動物實驗發(fā)現(xiàn)，增加Ⅰ型膠原的濃度可促進裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長。
　　6.胃癌組織中存在明顯的膠原重構現(xiàn)象，包括膠原纖維的含量明顯增加以及成熟度下降;同時，膠原纖維的形態(tài)發(fā)生明顯改變:其直徑更為粗大，彎曲度下降，嗜酸性下降，致密度增加。
　　7

11、.膠原纖維的相關參數(shù)，無論是反映單條纖維結構的參數(shù)（長度、寬度、直度），還是反映一組纖維的組織特點的參數(shù)（排列值、密度），在胃癌組織中均明顯上升。同時，膠原纖維的長度、寬度和密度與患者的預后密切相關，其中寬度的預后價值最大。
　　8.膠原受體DDR2可表達于胃癌細胞，表達量與預后密切相關，其中表達量較低的患者預后較差，但DDR2表達不是獨立的預后因素。同時，癌細胞DDR2低表達的胃癌，間質(zhì)中Ⅰ型膠原的含量明顯更高。
　　9.

12、在Ⅰ型膠原微環(huán)境中進行三維培養(yǎng)時，下調(diào)胃癌細胞DDR2的表達可提高其克隆形成率，并促進癌細胞的增殖和侵襲，而上調(diào)DDR2表達后，胃癌細胞的增殖和侵襲明顯被抑制。
　　10.裸鼠皮下移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)胃癌細胞DDR2的表達后，成瘤率明顯增加，且移植瘤體積明顯增大;而上調(diào)DDR2表達后，移植瘤生長被抑制。
　　結論:
　　1.GMS可作為胃癌預后評估的有用指標。胃癌存在兩類典型的腫瘤微環(huán)境:炎癥性微環(huán)境和促纖維增生性微環(huán)

13、境。具有炎癥性微環(huán)境的胃癌預后較好，PD-L1表達陽性率和EB病毒感染率更高，也更易于出現(xiàn)錯配修復基因的表達缺失;具有促纖維增生性微環(huán)境的胃癌含有豐富的腫瘤相關成纖維細胞和大量膠原纖維，預后較差。
　　2.Ⅰ型膠原纖維可促進胃癌的生長和侵襲，其含量與胃癌預后密切相關。同時，胃癌間質(zhì)中的膠原纖維發(fā)生了明顯的重構，表現(xiàn)為含量的增加（量變）和成熟度的降低（質(zhì)變），其形態(tài)和構筑特點（膠原纖維的長度、寬度、直度、密度和排列）也發(fā)生了明顯的變