補腎益精方促進自身骨髓干細胞修復干性年齡相關性黃斑變性的作用研究.pdf

1、目的:
　　干性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是發(fā)達國家65歲以上人群主要的致盲性眼病，屬于視網膜退行性疾病的范疇，此類疾病的病理基礎是視網膜神經元細胞的不可逆性損傷，目前臨床尚無有效的治療手段。近年細胞替代治療方法的出現，使視網膜退行性病變的修復成為可能。最新研究發(fā)現，通過動員機體自身骨髓來源細胞(bone marrow stem cells，BMCs)亦可達到修復

2、組織損傷的作用，相比傳統(tǒng)的骨髓干細胞移植方法更加安全易行。因此，促進自身BMCs動員及其在病變處的歸巢、定向分化很可能成為干細胞治療的新途徑。補腎益精方（BSYJ方）是我們臨床常用的治療干性AMD的基本方，前期臨床觀察發(fā)現其能顯著改善患者視功能。中醫(yī)理論中的“精”在內涵和功能上與干細胞具有相似性?；谝陨显?，本研究擬探討補腎益精方促進自身BMCs修復干性AMD損傷的作用及可能機制。
　　方法:
　　1.以碘酸鈉誘導的干性A

3、MD小鼠模型作為研究載體，將模型動物隨機分為中藥組及蒸餾水對照組（對照組），中藥組每日予BSYJ方灌胃，對照組以蒸餾水灌胃，以未造模的正常動物為正常對照（正常組），常規(guī)飼養(yǎng)。碘酸鈉造模小鼠于造模后第一天給藥，給藥7天、14天、28天后觀察視網膜電圖(electroretinogram，ERG)和組織病理學指標。
　　2.造模、分組、給藥方法同上。分別于治療后7天、14天、28天處死動物，眼眶取血，采用流式細胞儀檢測外周血液中Lin

4、-/Sca-1+/c-kit+細胞數量。同時，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、基質細胞衍生因子-1α(stromal cellderived factor-1，SDF-1α)及其受體趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor4，CXC

5、R-4）的含量。
　　3.造模、分組、給藥方法同上。造模后第1天，移植綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)轉基因小鼠（遺傳背景為C57/BL6小鼠）的BMCs。每只小鼠經尾靜脈注射細胞數3×106，次日開始治療。分別于治療后7天、14天、28天處死小鼠，眼眶取血，視網膜組織勻漿，采用ELISA方法檢測外周血及視網膜組織SDF-1α、CXCR-4含量。取小鼠眼球，分離視網膜-脈絡膜-鞏膜復合體，放

6、射狀切開鋪片，激光共聚焦顯微鏡下觀察攜帶GFP的BMCs在整個視網膜的分布情況。取小鼠視網膜，采用Western-Blotting方法半定量觀察視網膜細胞間黏附因子(intercellular adhesion molecule1，ICAM-1)以及粘纖連蛋白（fibronectin，FN）的蛋白水平。
　　4.造模、分組、給藥方法同上，分別于治療后7天、14天、28天利用RT-PCR檢測視網膜睫狀神經營養(yǎng)因子（ciliary n

7、eurotrophic factor，CNTF），成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrhophicfactor，BDNF) mRNA表達。
　　結果:
　　1.與正常組比較，造模后對照組和中藥組ERG各項指標均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療7d、14d、28d后，與對照組比較，中藥組明視條

8、件ERG潛伏期a、潛伏期b、振幅b顯著改善，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療14d和28d后，與對照組比較，中藥組明視條件ERG振幅a顯著改善，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療28d后，與對照組比較，中藥組暗適應條件ERG振幅a、振幅b，最大混合反應振幅a、振幅b，振蕩電位振幅Toal，30Hz閃爍光振幅顯著改善，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網膜感光細胞形態(tài)和數量顯著改善，差異具有統(tǒng)計學意

9、義(P＜0.05)。
　　2.治療7d后，中藥組外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細胞相對數量與對照組和正常組比較顯著增高(P＜0.05)。治療7d、14d和28d后，中藥組外周血G-CSF、SDF-1α及其受體CXCR-4含量與對照組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　3.治療7d、14d和28d后，中藥組視網膜組織歸巢GFP-BMCs數量較對照組組顯著增加（P≤0.01）。治療14d和28d后，對照組外周血和中藥

10、組視網膜組織SDF-1α及CXCR-4含量較對照組顯著增加（P＜0.01）。治療7d、14d、28d后，視網膜組織ICAM-1表達顯著增加(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網膜組織FN表達顯著增加(P＜0.05)。
　　4.治療7d，14d和28d，與對照組比較，視網膜組織中CNTF mRNA表達均顯著增加(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網膜組織BDNF和bFGFmRNA表達顯著增加（P＜0.05）。
　　

11、結論:
　　1.BSYJ方對干性AMD具有保護作用，能延緩干性AMD疾病的進程。
　　2.BSYJ方對碘酸鈉誘導干性AMD小鼠BMCs具有動員、遷移作用，這可能與增加相關細胞因子C-GSF含量，啟動SDF-1α/CXCR-4信號軸有關。
　　3.BSYJ方能促進BMCs向損傷的視網膜歸巢，這可能與其能增加黏附分子ICAM-1和FN的表達有關。
　　4.BSYJ方能延緩干性AMD病理改變，這可能與促進BMCs歸巢和