鞘內(nèi)注射人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細胞對長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用.pdf

1、本文第一部分構(gòu)建bIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體及其在骨髓間質(zhì)干細胞中的表達 目的:構(gòu)建帶有hIL-10基因的腺病毒載體，并感染大鼠骨髓間質(zhì)干細胞(ratmesenchymal stem cells，rMSCs)后，進一步檢測hIL-10表達從而獲得有生物活性hIL-10修飾的rMSCs(hIL10-rMSCs)。 方法:以pSNAV2.0-hIL10重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得hIL10cDNA片段，

2、經(jīng)酶切連接到帶有EGFP標記的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha載體質(zhì)粒上，PmeI線性化重組質(zhì)粒pDC316-hIL10-IRES-EGFP，與腺病毒包裝系統(tǒng)：AdMax轉(zhuǎn)染293包裝細胞，包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒，經(jīng)反復(fù)感染293細胞擴增病毒后，進行離子交換法純化病毒，并測定病毒顆粒數(shù)、滴度。所獲重組腺病毒感染rMSCs后，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察測定重組腺病毒感染rMSCs的感染率，Western- b

3、lotting法測定rMSCs hIL-10蛋白表達水平。 結(jié)論:已成功構(gòu)建含hIL10和EGFP基因的雙順反子重組腺病毒載體，其對rMSCs具較高感染率并能很好地表達目的基因hIL10，這為下一步hIL-10免疫抑制治療研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 第二部分脊髓膠質(zhì)細胞及前炎性細胞因子在長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機制 目的:探討脊髓星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞以及前炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞

4、介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)在長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。 方法:雄性SD大鼠隨機分為模型組和對照組。模型組通過大鼠腹腔內(nèi)重復(fù)注射長春新堿建立神經(jīng)病理性疼痛模型；以第1次注射長春新堿為第1天，模型組第1～5天和第8～12天腹腔注射0.1mg·(kg·d)-1長春新堿注射液(以生理鹽水稀釋至1mL)。對照組注射1mL生理鹽水，余處理同模型組。通過檢測機械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL

5、)來評價動物痛行為學(xué)改變。采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等方法，檢測脊髓星形膠質(zhì)細胞GFAP和小膠質(zhì)細胞OX-42的表達以及脊髓前炎性細胞因子IL-1β、IL-6及TNFαmRNA表達的變化，評價脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化情況及脊髓前炎性細胞因子表達與疼痛行為改變的關(guān)系。 結(jié)論:大鼠腹腔內(nèi)重復(fù)注射長春新堿成功地建立了化學(xué)藥物致神經(jīng)病理性疼痛模型；長春新堿誘發(fā)的脊髓膠質(zhì)細胞活化及前炎性細胞因子IL-1β

6、、IL-6和TNFα的表達增加，可能在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起著重要的作用。 第三部分鞘內(nèi)注射人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細胞對長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用 目的:人IL-10基因修飾的間質(zhì)干細胞(hIL10-MSCs)經(jīng)皮鞘內(nèi)注射入長春新堿致神經(jīng)病理性疼痛大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察其在蛛網(wǎng)膜下腔存活情況及其對大鼠的鎮(zhèn)痛作用及可能機制。 方法:長春新堿反復(fù)腹腔注射制備神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型。模型大鼠60

7、只隨機分為hIL10-MSCs組、空載體-MSCs組及對照組，每組20只。hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組分別經(jīng)皮鞘內(nèi)注射hIL10-MSCs細胞懸液(1×106cells/mL)以及空載體-MSCs細胞懸液(1×106cells/mL)各30uL；對照組經(jīng)皮鞘內(nèi)注射生理鹽水30uL。各組大鼠分別于鞘內(nèi)注射前，鞘內(nèi)注射后3、7、14天測定機械性痛閾(PWT)和熱痛敏潛伏期(PWL)，同時應(yīng)用熒光激發(fā)、ELISA法、免疫組化及W

8、B技術(shù)檢測hIL10-MSCs在蛛網(wǎng)膜下腔存活情況，腰段脊髓hIL10蛋白及脊髓膠質(zhì)細胞GFAP、OX-42、IL-1β、IL-6和TNFα表達情況。 結(jié)果與對照組和空載體-rMSCs組相比，hIL10-MSCs組鞘內(nèi)注射后3、7、14天PWT及PWL均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，而空載體-MSCs組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；hIL10-MSCs組和空載體-MSCs組鞘內(nèi)注射細胞7、14天后在

9、熒光激發(fā)下可見綠色熒光細胞，而對照組則未見綠色熒光細胞：對照組、空載體-MSCs組各時間點均未檢測到人白介素10蛋白表達，hIL10-MSCs組腰段脊髓組織人白介素10含量在鞘內(nèi)注射細胞后3、7、14天分別為1.24±0.25ng/mg.2.24±0.30 ng/mg、1.82±0.29 ng/mg。與對照組及空載體-MSCs組相比，hIL10-MSCs組腰段脊髓膠質(zhì)細胞GFAP、OX-42表達明顯降低，IL-1β、IL-6和TNFα表