桔梗多糖硒化物的活性研究.pdf

1、目的:以桔梗為原料，提取桔梗中的多糖、分離純化得到純凈的桔梗多糖，然后對其結構進行硒化修飾，并對硒化工藝進行了研究，在此基礎上考察它們的生物活性并進行比較。
　　方法:采用超臨界CO2萃取技術輔助水提醇沉的方法提取桔梗中的多糖，以桔梗多糖的收率和多糖的含量為指標，采用正交設計優(yōu)化超臨界CO2方法萃取的工藝條件；利用DEAE-52纖維素柱和葡聚糖凝膠純化后再用SephadexG-75層析柱進行二次純化。以桔梗多糖為原料，在硝酸催化劑

2、的作用下加入亞硒酸鈉，使桔梗多糖與亞硒酸鈉反應，生成有機硒化物（桔梗硒多糖），用HPLC法檢測有機硒化物的硒含量，以桔梗硒多糖的產率和硒含量為指標，確定其桔梗硒多糖合成的最佳工藝。采用鄰苯三酚自氧化法測定桔梗多糖和桔梗硒多糖對超氧陰離子自由基的清除作用，水楊酸法測定羥自由基清除作用， HPLC法測定DPPH濃度評價對DPPH自由基的清除作用，并與維生素C進行了比較，考察其抗氧化活性。以對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，通過UV-

3、vis法對硝基酚的測定，考察桔梗多糖和桔梗硒多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并且確定其抑制類型。用昆明種小鼠（SPF級）48只分成6組，即正常組（空白組）、模型組、陽性組（聯(lián)苯雙脂組）、桔梗硒多糖低、中、高劑量組，每組8只。正常飼養(yǎng)一周后，桔梗硒多糖低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃給藥14 d，高劑量組給藥2.0 g?kg-1，中劑量組給藥1.0 g?kg-1，低劑量組0.5 g?kg-1，陽性組（灌聯(lián)苯雙脂）1.0 g?kg-1，正常組和陰

4、性對照組灌胃等量生理鹽水，第7 d給藥1 h后除正常組外，各組小鼠腹腔注射0.2％的CCl4橄欖油溶液10 mL?kg-1；第14 d末次給藥1 h后除正常組以外，各組小鼠腹腔注射0.2％的CCl4橄欖油溶液10 mL?kg-1，24 h后稱重。摘眼球采血，3000 r?min-1離心15 min，分離血清測定谷丙轉氨酶（ ALT）、谷草轉氨酶（ AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）

5、、總蛋白（TP）的含量，同時測定肝組織勻漿中的還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量。從肝的相同部位取肝組織，甲醛固定、包埋、HE染色，進行組織形態(tài)學考察。
　　結果:超臨界CO2萃取的最佳工藝是：溫度為45℃，萃取壓力為25 MPa，乙醇濃度為70%，時間為1.5 h。用DEAE–52對粗多糖進行分離純化時，洗脫液為蒸餾水時得到一個明顯的多糖峰，質量為0.1342g，得率為28.21%。用0.5mol/L NaHCO3

6、溶液洗脫時，只有明顯的多糖和蛋白質的重疊峰，沒有多糖單峰。用1.0 mol/L的NaHCO3洗脫時，只有蛋白質峰而無單糖峰。再次利用 SephadexG-75做一步純化。洗脫液為三蒸水，得到一種純品桔梗多糖，質量為3.8mg，得率為79%。通過單因素實驗和正交實驗得出了桔梗硒多糖的最佳制備工藝條件；該條件為：反應時間為5 h，超聲波頻率和溫度為60%和60℃，催化劑濃度為6%。桔梗硒多糖的產率是15.66%，硒含量2.282 mg/g。

7、急毒實驗結果未能測出 LD50，其毒性比 Na2SeO3的毒性低。對超氧自由基的清除能力的實驗結果：桔梗多糖、桔梗硒多糖和Vc的IC50值分別為1.021 mg/mL、0.512 mg/mL和0.042mg/mL；對羥基自由基的清除能力的實驗結果：桔梗多糖、桔梗硒多糖和Vc的IC50值分別為1.269 mg/mL、0.458 mg/mL和0.596 mg/mL；對DPPH自由基的清除能力的實驗結果：桔梗多糖、桔梗硒多糖和 Vc的 IC5

8、0值分別0.312mg/mL、0.230 mg/mL和0.156 mg/mL；對總還原能力的測試，在相同的質量濃度下，Vc的還原能力>桔梗硒多糖>桔梗多糖。桔梗多糖、桔梗硒多糖及阿卡波糖最大抑制率分別為70.07%、79.78%和94.21%，其IC50值分別為1.10 mg/mL、0.82 mg/mL和0.41 mg/mL。桔梗多糖為競爭性抑制型，桔梗硒多糖為非競爭性與競爭性抑制混合型。保肝實驗結果：桔梗硒多糖對CCl4所致的小鼠的肝

9、損傷，均可以不同程度的降低血清中的ALT（P＜0.05）、AST（P＜0.05）的水平以及肝組織中的 MDA（P＜0.05）含量，升高肝組織中的 GSH（P＜0.05）水平。
　　結論:經(jīng)過超臨界CO2輔助提取工藝萃取后，桔梗多糖的產率和含多糖的量明顯提高。大大提高了桔梗的利用率，由于該法提取工藝簡單，過程省去了化學方法的脫脂脫色，減少了化學藥物對多糖的污染；經(jīng)過對多糖的硒化工藝的研究，證明了此種硒化方法簡單易行，硒含量高，毒性小