聚醚砜膜對AST生物學行為的影響及ACM對缺氧與機械損傷神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、前言 星形膠質(zhì)細胞(AST)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)主要的膠質(zhì)細胞成分之一，在CNS的發(fā)育和再生中起著十分重要的作用。研究表明在正常和活化狀態(tài)下，AST可分泌包括神經(jīng)營養(yǎng)因子在內(nèi)的細胞因子多達100余種。其中神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等。有研究表明，NGF可明顯減輕創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞的死亡及凋亡，這與其神經(jīng)細胞保護作用相關。在神經(jīng)損傷后，BDNF可通過某些機制對神經(jīng)元起保護作用。研究發(fā)

2、現(xiàn)，單一神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用比較局限，實現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的多因子協(xié)同的一個很好的手段就是利用生物反應器，利用生物反應器培養(yǎng)AST分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過一系列方法濃縮培養(yǎng)濾液，將可能獲得含多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合液。利用聚醚砜(polyethersulfone，PES)半透膜構建的生物反應器培養(yǎng)肝細胞已有成功的經(jīng)驗，但培養(yǎng)AST是否可行，對AST形態(tài)、增殖能力與功能的影響如何也無相關的文獻報道。 研究發(fā)現(xiàn)，AST的條件培養(yǎng)液(Astro

3、cyte-conditioned medium，ACM)中含有多種神經(jīng)營養(yǎng)成分，包括NGF和BDNF等細胞活性成分，提示ACM可能具有促進損傷神經(jīng)元存活與功能恢復的作用。CNS損傷后的病理生理改變多伴有腦缺血、缺氧，而神經(jīng)細胞的缺氧性損傷是一個啟動神經(jīng)毒性的循序的級聯(lián)損傷反應。在這個過程中，一氧化氮(NO)起了很大作用，大量產(chǎn)生的NO可介導谷氨酸激活NMDA受體加重神經(jīng)元的損害；過量合成的NO也可損傷線粒體的電子傳遞系統(tǒng)，抑制能量代謝及

4、DNA合成。乳酸脫氫酶(LDH)，作為細胞內(nèi)的一種標志酶，當細胞受損時，細胞膜通透性發(fā)生改變，LDH釋放量明顯增加，因此，通常以LDH在細胞液中的透過量作為衡量神經(jīng)元的損傷程度和細胞膜通透性的指標之一。腦缺血缺氧可導致神經(jīng)元的死亡或凋亡。腦缺血缺氧首先造成神經(jīng)細胞的能量代謝障礙，導致ATP的耗竭。機械性損傷模型與創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)病機制最相似，外傷致腦缺血缺氧可導致神經(jīng)元的死亡或凋亡。 目的 研究體外培養(yǎng)小鼠AST增殖及其分

5、泌NGF和BDNF的規(guī)律，以及聚醚砜膜對AST生長、存活增殖及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響；通過體外細胞模型，研究體外培養(yǎng)的小鼠ACM對缺氧、機械損傷神經(jīng)元的保護作用及相關機制。 方法 1、取新生KM小鼠的皮層進行AST純化培養(yǎng)。原代培養(yǎng)時，分為普通培養(yǎng)板組和聚醚砜膜組，在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9(天)用CCK-8試劑盒測定、比較兩組各時間點細胞數(shù)。同法測定AST在傳第一代后不同時間點(第1、3、7、14、21天)，及傳第1

6、至6代每代的第5天的細胞數(shù)，用ELISA試劑盒測定各時間點ACM中NGF和BDNF的含量，得出變化趨勢。 2、AST傳代純化培養(yǎng)后分為三組：A普通培養(yǎng)板組、B聚醚砜膜組、C層粘連蛋白包被膜組，觀察和比較細胞形態(tài)學、細胞存活增殖能力的變化，同時測定并比較不同處理組別問培養(yǎng)基中NGF、BDNF含量。 3、體外分離培養(yǎng)KM小鼠皮層神經(jīng)元，取傳代培養(yǎng)第三代第5天的不同濃度的ACM作用于正常培養(yǎng)神經(jīng)元，在ACM作用3天、6天后，用

7、CCK8法分別測定各時間點神經(jīng)元細胞數(shù)，觀察ACM的濃度變化對神經(jīng)元存活的影響。 4、通過三氣培養(yǎng)箱缺氧處理建立神經(jīng)元缺氧損傷模型，采用微量移液器塑料滴頭機械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)細胞建立神經(jīng)元機械損傷模型；把20％ACM分別加入到缺氧/復氧損傷及機械損傷的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液中，測定ACM對缺氧及機械損傷神經(jīng)元的存活及采用相應試劑盒檢測其合成和釋放。NO、LDH的變化，對缺氧損傷神經(jīng)元同時檢測胞膜ATP酶(ATPase)活性的變化，籍以

8、探討ACM對缺氧及機械損傷神經(jīng)元保護作用的相關機制。 結果 1、在原代培養(yǎng)時，兩組細胞都表現(xiàn)為持續(xù)的增殖，聚醚砜膜組第3天、5天、7天的細胞OD值較普通培養(yǎng)板組明顯低(P<0.05)。傳代培養(yǎng)后，三組細胞增殖變化趨勢相似，均表現(xiàn)為持續(xù)快速增殖，到第7天達到高峰，以后細胞數(shù)量隨時間逐漸減少。比較傳代后各代細胞第5天的細胞數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)第1代、2代、3代細胞表現(xiàn)為輕度上升，第3代后表現(xiàn)為減少，但第1至第5代相鄰代問細胞數(shù)無明顯

9、差異，第6代(0.32±0.032)比第5代(0.376±0.039)明顯下降(P<0.05)。 2、與常規(guī)培養(yǎng)的A組相比，生長在PES膜上的B組細胞胞體略小，胞核清晰，突起較短，GFAP免疫熒光染色顯示其GFAP表達較培養(yǎng)在蓋玻片上的AST明顯增強。而C組的AST細胞與B組細胞比較，細胞胞體伸展，突起明顯，免疫熒光染色顯示GFAP表達較弱，與A組相近。從細胞生長曲線看，培養(yǎng)第3天后(第3、7、14、21天)B組細胞數(shù)(0.21

10、5±0.026、0.302±0.075、0.150±0.031、0.135±0.015)較A組、C組減少(P<0.05)，A組與C組在第1天、3天、7天細胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。在傳代培養(yǎng)期，三組的細胞分泌NGF和BDNF的量與能力也呈相似的變化趨勢。用各組各時間點細胞的NGF和BDNF分泌量與相應的細胞數(shù)OD值比較，代表單位細胞的分泌能力，結果傳代培養(yǎng)的第7天的細胞分泌NGF和BDNF能力最強，第14天后單位細胞的分泌能力明顯

11、下降。而在組間比較發(fā)現(xiàn)B組的單位細胞分泌NGF和BDNF能力較A、C兩組低，以第7～14天明顯。 3、在ACM作用3天和6天后，10％ACM組(0.145±0.079/0.206±0.083)和20％ACM組的OD值(0.187±0.074/0.210±0.077)明顯高于正常完全培養(yǎng)基組(0.125±0.067/0.150±0.066)和50％ACM(0.134±0.034/0.145±0.034)和70％ACM組(0.075

12、±0.035/0.085±0.020)，差異明顯(P<0.05)，而ACM作用6天后10％ACM組和20％ACM組間無明顯差異(P>0.05)。 4、用含20％ACM培養(yǎng)基作用于不同缺氧復氧時間的神經(jīng)元細胞。常規(guī)培養(yǎng)基(低糖)培養(yǎng)的缺氧神經(jīng)元隨著缺氧時間的延長細胞數(shù)呈下降趨勢，缺氧24小時細胞數(shù)(H24RO：0.048±0.004、H24R24：0.039±0.010)下降明顯，與缺氧8h(H8RO：0.063±0.006、H8

13、R24：0.058±0.011)比顯著下降(P<0.05)。而各缺氧時間再復氧后細胞表現(xiàn)為細胞數(shù)再下降，H8R0與H8R24；H24RO與H24R24組間均有明顯差異。加入20％ACM培養(yǎng)基后神經(jīng)元在各時間點(除外H4R24)的OD值(H4RO：0.076±0.012、H8RO：0.074±0.013、H8R24：0.063±0.010、H24RO：0.055±0.011、H24R24：0.046±0.013)較對照組(H4RO：0.0

14、76±0.012、H8RO：0.063±0.006、H8R24：0.058±0.011、H24RO：0.048±0.004、H24R24：0.039±0.010)升高，差異顯著(P<0.05)。 與對照組相比，20％ACM作用的缺氧神經(jīng)元，在H4R24、H8R0、H8R24、H24R0、H24R24各組的NO值均有明顯下降；而LDH釋放比則在H8R0、H8R24、H24R0、H24R24各時間點值也有明顯降低；ATPase則表現(xiàn)

15、為在H4R24、H8R0、H8R24、H24R0、H24R24有明顯增高，均P<0.05。 5、在神經(jīng)元機械損傷模型中，傷后1h兩組細胞數(shù)已開始下降，隨時間推移繼續(xù)減少。損傷組間對比，隨損傷程度加重細胞數(shù)隨之下降，在傷后6h和24h更加明顯。與常規(guī)培養(yǎng)基組對比，加入20％ACM后，各損傷組傷后細胞數(shù)明顯多于常規(guī)培養(yǎng)基組(P<0.05)，這種變化在中重型損傷組傷后1小時即能看到，6到24小時后更加明顯。測定NO及LDH的變化，在傷

16、后lh，損傷組NO和LDH即開始上升，6h、24h后更加明顯；加入20％ACM培養(yǎng)6h、24h后，NO的濃度(μmol/L)(1.632±0.423、3.293±0.427)明顯比常規(guī)培養(yǎng)基組(2.658±0.445、4.017±0.395)減低，P<0.05；而LDH濃度(U/L)則在傷后1h、6h、24h的損傷組都比常規(guī)培養(yǎng)基組明顯下降(P<0.05)。 結論 1、傳代后連續(xù)培養(yǎng)的AST細胞數(shù)持續(xù)增長至第7天，后細胞

17、數(shù)下降；不斷傳代的AST，在第6代后細胞增殖能力開始明顯下降； 2．聚醚砜膜對AST的存活增殖有一定抑制作用，并降低AST分泌NGF和BDNF的能力，層粘連蛋白在一定程度上可減輕聚醚砜膜對AST功能的抑制作用； 3．ACM對正常和缺氧神經(jīng)元的存活均有一定促進作用，其機制可能與減少NO、LDH合成與釋放，并保護和提高細胞膜上ATPase的活性有關； 4．ACM對機械損傷神經(jīng)元的存活同樣具有一定的促進和保護作用，減少