重金屬銻通過上調(diào)CtBP2表達促進前列腺癌進展機制.pdf

1、目的：
　　明確低劑量重金屬銻暴露后，對前列腺癌進展產(chǎn)生的影響，并初步探討其作用機制。
　　方法：
　　采用MTT方法篩選銻暴露PC3細胞的亞致死劑量，并明確在該劑量下銻對PC3細胞增殖效應(yīng)的影響；明確銻暴露影響細胞增殖最顯著劑量后，用該劑量銻處理PC3細胞，分別通過細胞劃痕實驗、Transwell實驗以及磷脂酰絲氨酸外翻法分析，研究銻暴露對細胞遷移能力、侵襲能力及凋亡能力的作用；采用基因轉(zhuǎn)錄組測序的方法，研究低劑量銻

2、暴露 PC3細胞后，基因異常表達情況；根據(jù)基因測序結(jié)果，分別采用RT-qPCR及Western Blot方法，研究低劑量銻暴露對CtBP2以及下游蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯水平的影響；通過比對CtBP2轉(zhuǎn)錄起始上游DNA序列，查詢金屬效應(yīng)元件（MRE）結(jié)構(gòu)，構(gòu)建MRE表達質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，予以低劑量銻暴露后，進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，證明MRE結(jié)構(gòu)與低劑量銻暴露的關(guān)系；建立銻暴露裸鼠荷瘤實驗?zāi)Ｐ秃?，明確低劑量銻對裸鼠及皮下腫瘤生長的影響

3、，并記錄裸鼠體重及皮下種植瘤體積變化，繪制生長曲線，采用Western Blot方法檢測其腫瘤組織中CtBP2以及下游蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　低劑量銻暴露可促進PC3細胞增殖，并發(fā)現(xiàn)在銻暴露劑量為8uM時，其促進增殖效應(yīng)最為顯著(P<0.05)；以8uM銻暴露PC3細胞后，細胞遷移以及侵襲能力均顯著增加(P<0.05)，但并不能增加其抗凋亡能力；根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，低劑量銻暴露PC3細胞后，多種基因出現(xiàn)顯著的差異

4、性表達，其中包括CtBP2表達水平顯著增加(P<0.05)；根據(jù)RT-qPCR方法驗證，低劑量銻暴露后PC3細胞中CtBP2 mRNA顯著增加，結(jié)合Western Blot實驗結(jié)果提示，CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)；通過比對CtBP2 DNA序列，證明其轉(zhuǎn)錄起始上游具有金屬效應(yīng)元件（MRE）結(jié)構(gòu)，因此 CtBP2為 MRE調(diào)控的效應(yīng)基因；成功構(gòu)建金屬效應(yīng)元件表達質(zhì)粒后，雙熒光素酶報告基

5、因系統(tǒng)結(jié)果證明，低劑量銻可以與該結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用，進一步促進下游 CtBP2表達增加；建立低劑量銻暴露裸鼠荷瘤實驗?zāi)Ｐ秃?，對照組與10mg/kg/d組裸鼠皮下種植瘤體積分別為(1344.9±882.8)mm3以及(2612.4±777.5)mm3，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，結(jié)果證實低劑量銻可顯著促進裸鼠種植瘤生長；而通過 Western Blot實驗證明在低劑量銻暴露后的裸鼠腫瘤組織中，CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111