UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究主要探討UBE2T在前列腺癌中促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用，并深入探討其分子機(jī)制。該研究不僅補(bǔ)充了UBE2T在腫瘤中的生物學(xué)功能，還進(jìn)一步完善了其作用機(jī)制。同時(shí)，也為臨床前列腺癌的診斷和治療提供新的可能靶點(diǎn)。
　　第一部分 E2泛素偶聯(lián)酶UBE2T與前列腺和乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性究
　　目的：
　　應(yīng)用前列腺癌、乳腺癌組織芯片研究UBE2T在不同臨床病理分級的前列腺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)差異，分析UBE2T與前

2、列腺癌、乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究UBE2T在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.運(yùn)用西安艾莉娜生物科技有限公司的前列腺癌組織芯片PR483a，采用免疫組織化學(xué)法檢測UBE2T在正常前列腺組織、原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位前列腺癌組織中的表達(dá)變化。
　　2.運(yùn)用西安艾莉娜生物科技有限公司的乳腺癌組織芯片BR1321，采用免疫組織化學(xué)法檢測UBE2T在正常前列腺組織，原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的

3、原位前列腺癌組織中的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.采用免疫組織化學(xué)法檢測前列腺癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明正常前列腺中UBE2T表達(dá)最低，原位前列腺癌中表達(dá)較高，而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位前列腺癌中UBE2T的表達(dá)最為顯著。
　　2.采用免疫組織化學(xué)法檢測前列乳癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明正常乳腺中UBE2T表達(dá)最低，原位乳腺癌中表達(dá)較高，而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位乳腺癌中UBE2T的表達(dá)

4、最為顯著。
　　3.UBE2T過表達(dá)的前列腺癌患者預(yù)后生存率明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.前列腺癌和乳腺癌組織芯片的免疫組化結(jié)果證實(shí)UBE2T在已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位腫瘤組織中表達(dá)最為顯著，在原位腫瘤組織中表達(dá)低于前者，正常組織中表達(dá)最低。這表明UBE2T與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。
　　第二部分 UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、EMT及侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：
　　第一部分結(jié)果提示UBE2T表

5、達(dá)可能與前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，我們希望通過相應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤、轉(zhuǎn)移模型來驗(yàn)證UBE2T是否促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法：
　　1.采用UBE2T基因過表達(dá)質(zhì)粒pBabe-UBE2T及其對照空白質(zhì)粒，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法在前列腺癌細(xì)胞系Du145和PC3構(gòu)建UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系及對照細(xì)胞系:Du145-pBabe-UBE2T，Du145-pBabe，PC3-pBabe-UBE2T，PC3-p

6、Babe。上述細(xì)胞系經(jīng)2ng/mL嘌呤霉素篩選后，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westem blot)檢測UBE2T的表達(dá)改變。
　　2.采用兩個(gè)UBE2T基因沉默質(zhì)粒pSuper-shUBE2T.A和pSuper-shUBE2T.D及對照空白質(zhì)粒，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法在前列腺癌細(xì)胞系Du145和PC3構(gòu)建UBE2T沉默細(xì)胞系及對照細(xì)胞系:Du145-pSuper-shUBE2T.A，Du145-pS

7、uper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D,PC3-pSuper。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系經(jīng)2ng/mL嘌呤霉素篩選后，RT-PCR和Western blot檢測UBE2T的表達(dá)改變。
　　3.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)或沉默的細(xì)胞系，通過MTT和克隆形成檢測UBE2T對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系，顯微鏡下觀察UBE2T對細(xì)胞形態(tài)的

8、影響，通過western blot，免疫熒光和免疫組化等方法檢測UBE2T對EMT標(biāo)志蛋白(E-cadherin，Vimentin，F(xiàn)ibronectin，alpha-smooth muscle acting)表達(dá)的影響。
　　5.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系，通過劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測UBE2T對前列腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響;Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測UBE2T對前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

9、　　6.應(yīng)用穩(wěn)定過表達(dá)UBE2T的前列腺癌細(xì)胞系及其空白對照細(xì)胞系，通過皮下注射和尾靜脈注射的方式，建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型，檢測UBE2T對腫瘤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。
　　7.應(yīng)用UBE2T沉默的前列腺癌細(xì)胞系及其空白對照細(xì)胞系，通過皮下注射和尾靜脈注射的方式，建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型，檢測UBE2T對腫瘤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。
　　8.采用免疫組化的方法，檢測瘤體和轉(zhuǎn)移灶中UBE2T的表達(dá)。<

10、br>　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建UBE2T過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞系及空白對照細(xì)胞系:
　　Du145-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。
　　2.成功構(gòu)建UBE2T沉默前列腺啊細(xì)胞系及空白對照細(xì)胞系:Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper,PC3-pSuper-shUB

11、E2T.D, PC3-pSuper。
　　3.過表達(dá)UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)沉默UBE2T能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長速度。
　　4.UBE2T促使前列腺癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。
　　5.過表達(dá)UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞間質(zhì)分子標(biāo)志物(Vimentin，F(xiàn)ibronectin，alpha-SMA)的表達(dá)，抑制上皮分子標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)。
　　6.UBE2T能夠促進(jìn)

12、前列腺癌細(xì)胞體外遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明UBE2T促進(jìn)前列腺腫瘤的生長。
　　8.裸鼠轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)表明UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：
　　1.UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖。
　　2.UBE2T具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞EMT及體外遷移、侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　3.UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 UBE2T促進(jìn)

13、前列腺癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制究
　　目的：
　　體外實(shí)驗(yàn)證明UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移，但是其作用機(jī)制尚不明確，該部分目的在于通過一系列實(shí)驗(yàn)探討UBE2T可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.串聯(lián)親和質(zhì)譜分析(Tandem affinity purification and Mass Spectrometry，TAP-MS)檢測可能與UBE2T相結(jié)合的蛋白。
　　2.利用

14、前列腺癌組織芯片檢測UBE2T與靶蛋白Vimentin之間的相關(guān)性。
　　3.通過western blot實(shí)驗(yàn)，檢測在放線菌酮(CHX)作用下UBE2T對Vimentin蛋白半衰期的影響
　　4.利用上述方法檢測另一靶向Vimentin的分子FBXW7對Vimentin半衰期的影響。
　　5.通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP實(shí)驗(yàn)，分析UBE2T、FBXW7和Vimentin三者之

15、間的相互作用。
　　6.通過western blot實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證UBE2T和FBXW7是否共同影響Vimentin的蛋白水平。
　　7.通過Co-IP檢測UBE2T能夠影響FBXW7和Vimentin之間的結(jié)合及FBXW7對Vimentin的降解。
　　8.通過系列點(diǎn)突變、Co-IP等試驗(yàn)，分析UBE2T第95位氨基酸是否是UBE2T與Vimentin的結(jié)合位點(diǎn)。
　　9.將UBE2T第95位氨基酸突變成同性質(zhì)的其

16、他氨基酸，檢測突變后的UBE2T對前列腺啊細(xì)胞增殖，遷移及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：
　　1.TAP-MS、蛋白半衰期等試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vimentin是UBE2T可能的靶蛋白之一。
　　2.組織芯片結(jié)果表明在前列腺癌組織中UBE2T的表達(dá)水平與Vimentin的表達(dá)正相關(guān)。
　　3.UBE2T能夠延緩Vimentin的降解，而FBXW7能夠促進(jìn)Vimentin的降解。
　　4.UBE2T能夠抑制FBXW7所

17、引起的Vimentin的降解。
　　5.UBE2T能夠影響FBXW7與Vimentin之間的結(jié)合，從而影響Vimentin的表達(dá)。
　　6.UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T與Vimentin的結(jié)合位點(diǎn)。
　　7.UBE2T第95位氨基酸突變能夠抑制UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，遷移及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　結(jié)論：
　　1.Vimentin是UBE2T的靶蛋白，UBE2T能夠延緩Vimentin的降解。