豬長非編碼RNA-TncRNA的分離、特征鑒定及功能的初步分析.pdf

1、非編碼RNA是一類不編碼蛋白質而直接行使結構、催化和調節(jié)功能的RNA分子,它廣泛存在于生物體的基因組中。長非編碼RNA是眾多非編碼RNA中的一種,具有類似mRNA的結構,至少占生物體10％的poly(A)+RNAs。近來研究表明,這類非編碼參與眾多的生物學過程,如表達調控、基因組印記以及應激反應等。
　　 TncRNA是從本室LongSAGE文庫中分離得到的一種長非編碼RNA,它在豬胎兒骨骼肌發(fā)育過程中是上調表達的,且在通城和長

2、白豬妊娠第90天胎兒骨骼肌差異表達。其他物種上的研究表明該非編碼RNA在多種病毒感染以及發(fā)育相關表達性文庫中差異表達,但其基本的分子結構和生物學功能還不清楚。本研究一方面從比較基因組學的角度出發(fā),探求其基本的分子結構、受調控機制以及可能的生物學功能,另一方面,從候選基因的角度,通過染色體定位、SNP檢測和群體分型以及初步的性狀關聯(lián)分析,為豬的功能基因組領域積累新的基礎資料,為豬的分子標記輔助選擇提供新的思路。主要的研究結果如下:

3、　　 1.從本室構建的豬出生前骨骼肌LongSAGE文庫中分離到一個非編碼RNA,并用豬輻射雜種板將其定位于豬2p14-17,與SW256標記連鎖,序列同源性比對分析發(fā)現其對應于人類11號染色體上的一個滋養(yǎng)層細胞來源的非編碼RNA-TncRNA。克隆了豬TncRNA的全長cDNA和基因組序列,并分析了它的基因組結構和選擇性剪接情況。
　　 2.生物信息學結果表明TncRNA僅存在于真哺乳亞綱動物中,多序列比對結構顯示在真哺乳亞

4、綱動物中,序列的歧化非常大,但他們之間都存在一個200bp的高保守區(qū)域。RNA序列的二級結構和功能性位點預測發(fā)現該非編碼RNA具有異常復雜的二級結構,且存在多個Sm蛋白的結合位點。
　　 3.時期表達譜顯示TncRNA在中外豬品種胎兒骨骼肌中是上調表達的,并且在品種間差異表達。組織表達譜結果表明該非編碼RNA在成年母豬大部分組織中都表達。
　　 4.克隆了人類TncRNA的啟動子區(qū)域,并利用生物信息學獲取了多個物種的上游

5、調控區(qū)。利用缺失片段構建的報道子表達載體轉染人類A549細胞和A204細胞,獲取了一個長150 nt的核心啟動子區(qū)域,并且還發(fā)現該啟動子區(qū)域具有反向啟動的活性；多序列比對發(fā)現該核心區(qū)在物種間是保守的。反式作用因子的預測表明該核心調控區(qū)存在Sp1、CREB、HSF2/1等的結合位點,且這些結合位點中,大部分在物種間是完全一致的。抑制Sp1的結合導致轉錄活性下降72±7％(p<0.01)。
　　 5.在豬TncRNA物種間高度保守的

6、區(qū)域檢測到3個SNP位點,其中兩個完全連鎖,應用PCR-RFLP方法檢測了完全連鎖位點的多態(tài)性,并分析了不同豬品種(包括五個中國地方豬品種和兩個西方豬品種)的基因型及基因頻率。
　　 6.在我室與通城縣畜牧局合作組建的試驗群體中,對上述用PCR-RFLP方法檢測的SNP與部分生產性狀和免疫性狀進行初步的關聯(lián)分析,結果發(fā)現該位點不同基因型個體間的肌肉嫩度、pH1值和血紅蛋白濃度差異顯著(P<0.05),
　　 7.成功改造