骨髓間充質干細胞對膿毒癥小鼠凝血障礙影響的研究.pdf

1、目的：
　　1.體外研究小鼠骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的血管內皮細胞凝血酶調節(jié)蛋白(Thrombomodulin，TM)、內皮細胞蛋白C受體(Endothelial protein C receptor,EPCR)在基因及蛋白水平表達的影響。
　　2.體內研究
　　2.1觀察經(jīng)尾靜脈移植骨

2、髓間充質干細胞(BMSCs)后膿毒癥小鼠的生存情況及微循環(huán)灌注、肺損傷變化情況。
　　2.2觀察BMSCs移植后血管性血友病因子(Von willebrand factor，vWF)、組織因子(Tissue Factor，TF)、凝血酶-抗凝血酶混合物(Thrombin-antithrombincomplex，TAT)在膿毒癥小鼠血漿中分泌水平。
　　2.3觀察BMSCs移植后組織因子(TF)、凝血酶調節(jié)蛋白(TM)、內皮細

3、胞蛋白C受體(EPCR)在膿毒癥小鼠體內的基因和蛋白水平的表達情況。
　　2.4初步探討B(tài)MSCs在膿毒癥早期的治療作用與凝血的相關性。
　　方法：
　　1.體外實驗:
　　1.1根據(jù)細胞表面表型通過流式細胞技術以及細胞的多分化潛能來鑒定小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)
　　1.2 Transwell技術體外共培養(yǎng)BMSCs和血管內皮細胞，LPS刺激后6h，收集內皮細胞提取RNA和蛋白質進行多聚酶鏈式反應

4、(PCR)、Western Blot(WB)檢測TM、EPCR表達情況。
　　2.體內實驗:
　　2.184只雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組（Shame組）、膿毒癥組(CLP組)和BMSCs移植組（CLP+BMSCs組），通過盲腸結扎穿孔術制作小鼠膿毒癥模型，小鼠被隨機分為以下幾組:(Ⅰ)假手術組:經(jīng)尾靜脈注射0.3 ml無菌磷酸鹽(PBS);(Ⅱ) CLP對照組:經(jīng)尾靜脈注射0.3 mlPBS;(Ⅲ)CLP+BMS

5、Cs組:經(jīng)尾靜脈注射BMSCs懸液（含BMSCs1×106/0.3ml）。BMSCs懸液(含BMSCs1×106/0.3ml)和PBS0.3 ml均在小鼠造模后6h經(jīng)尾靜脈注射給入。造模24 h后，每組取4只小鼠在麻醉狀態(tài)下重新開腹，利用激光多普勒微循環(huán)儀觀察小鼠腸系膜血流灌注情況。
　　2.2在CLP造模24 h后，每組取8只小鼠麻醉后，留取血漿和肺組織進行后面酶聯(lián)免疫試驗、免疫組織化學、組織染色、RT-PCR和western-

6、blot檢測。
　　結果：
　　1.體外實驗:
　　1.1流式細胞儀分析結果顯示大于70％細胞CD29、CD44和Sca-1呈陽性表達，而CD34、CD31和CD117的陽性表達率小于5％。骨髓間充質干細胞在脂肪分化培養(yǎng)基和成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩到三周分別分化為脂肪和骨。
　　1.2與PBS對照組相比，LPS刺激顯著降低內皮細胞TM和EPCR mRNA轉錄和蛋白質表達。然而，BMSCs能夠顯著改善這種減少情況。<

7、br>　　2.體內實驗:
　　2.1 CLP組和CLP+ BMSCs組小鼠的4天生存率分別為31.25％和56.25％，BMSCs移植后膿毒癥小鼠的生存情況明顯得到改善，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.2造模后24 h，CLP組小鼠腸系膜灌流量明顯低于正常組，然而BMSCs移植后膿毒癥小鼠的腸系膜灌流量明顯改善。
　　2.3 Sham組小鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡隔及支氣管未見明顯炎細胞及滲出物。與

8、Sham組比較，CLP組小鼠肺組織嚴重水腫、出血，肺泡壁完整性被破壞，大量炎癥細胞浸潤;與CLP組比較，CLP+BMSCs組小鼠肺組織損傷明顯減輕，出血、細胞浸潤等情況明顯改善;與假手術組相比CLP對照組肺損傷評分較高，然而在BMSCs治療組肺損傷評分卻顯著減小。這些數(shù)據(jù)都說明了BMSCs移植后減輕了肺損傷。
　　2.4.與Sham組相比，CLP組血漿中分泌的vWF、TAT和TF量在24 h明顯增多;而CLP+BMSCs組相較于C

9、LP組vWF、TAT和TF分泌水平在24 h時間點均有顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　2.5.各組小鼠肺組織中TF、TM、EPCR在基因水平和蛋白水平都有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，CLP組TF表達水平明顯上升，CLP+BMSCs組顯著下降，相反CLP組TM、EPCR表達水平明顯下降，CLP+BMSCs組顯著上升。免疫組化結果顯示CLP組小鼠肺組織TF平均陽性積分光密度值明顯高于Sham組，CLP+BMSC

10、s組TF平均陽性積分光密度值和CLP組比較后可見明顯下降，相反CLP組小鼠肺組織TM、EPCR平均陽性積分光密度值明顯低于Sham組，CLP+BMSCs組TM平均陽性積分光密度值和CLP組比較后可見明顯升高。Western Blot結果顯示和免疫組化結果顯示結果一致。
　　結論：
　　骨髓間充質干細胞移植在改善膿毒癥小鼠的生存率和肺臟炎癥反應的基礎上明顯降低膿毒癥小鼠組織因子和凝血酶-抗凝血酶混合物的分泌，并且分別在基因和蛋