Mcl-1參與HBx和游離脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：Mcl-1參與HBx誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究 【研究背景和目的】 持續(xù)HBV感染是病毒引起的包括慢性肝炎、肝硬化等在內(nèi)的慢性肝病的主要原因，并與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在我國HBV感染是HCC最主要的病因。在HBV病毒所編碼的蛋白中，HBx蛋白是HBV非結(jié)構(gòu)基因編碼的多功能病毒調(diào)控蛋白，參與HBV的感染、復(fù)制等一系列致病過程，并對肝細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝、應(yīng)激、遷移等多種生物學(xué)功能具有廣泛而復(fù)雜

2、的影響，被認(rèn)為是HBV誘導(dǎo)肝癌發(fā)生過程中最主要的決定因素之一，而其確切致病機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明。越來越多的證據(jù)表明凋亡是HBV病毒誘發(fā)慢性肝病的重要介質(zhì)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)HBx可以增強(qiáng)肝細(xì)胞對凋亡信號的敏感性。這些證據(jù)提示我們HBx可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其誘發(fā)肝癌的作用，而HBx促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚無定論。 Bcl-2家族是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)凋亡與存活的最重要的一類蛋白家族，家族成員同時包括抗凋亡和促凋亡分子。其中Mcl-1

3、(Myeloid cell-leukemia-1)，中文譯為髓細(xì)胞淋巴瘤-1，是Bcl-2家族中重要的抗凋亡成員。目前發(fā)現(xiàn)Mcl-1廣泛表達(dá)于各類組織細(xì)胞，參與胚胎發(fā)育、造血干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持，以及細(xì)胞凋亡的動態(tài)調(diào)控。但是，Mcl-1是否參與HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡并在其中發(fā)揮重要作用目前國內(nèi)外均未見有系統(tǒng)報道。 本研究從細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物水平觀察HBx的表達(dá)對氧化應(yīng)激信號誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡敏感性的影響，同時觀察在此過程中Mcl-1表達(dá)

4、水平的改變，明確HBx在何種水平、以何種方式調(diào)節(jié)Mcl-1的表達(dá)；再結(jié)合腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)技術(shù)，闡明Mcl-1在HBx誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用；并結(jié)合臨床HBV陽性肝癌患者的肝組織樣本從組織水平明確HBx與Mcl-1表達(dá)的相關(guān)性。 【實(shí)驗(yàn)方法】 1．構(gòu)建HBx和Mcl-1過表達(dá)及干擾質(zhì)粒、包裝表達(dá)HBx、Mcl-1和干擾Mcl-1的腺病毒、篩選建立HBx穩(wěn)定細(xì)胞系； 2．通過流式細(xì)胞技術(shù)觀察瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)HBx的

5、細(xì)胞系對氧化應(yīng)激信號敏感性的變化； 3．通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)、RT-PCR和real-time PCR技術(shù)以及Westernblot方法分別觀察表達(dá)HBx的細(xì)胞系在氧化應(yīng)激信號暴露下對Mcl-1啟動子轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)錄水平及其蛋白質(zhì)水平的影響； 4．使用通路特異性抑制劑實(shí)驗(yàn)開展HBx對Mcl-1表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制研究； 5．運(yùn)用熒光TUNEL法和流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證抑制相關(guān)信號通路和過表達(dá)Mcl-1在HBx誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

6、亡中的作用； 6．建立HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝氧化應(yīng)激刺激模型，運(yùn)用組織TUNEL、Western blot方法從體內(nèi)水平驗(yàn)證HBx對Mcl-1蛋白水平及肝臟細(xì)胞凋亡的影響； 7．免疫組化結(jié)合Western blot方法觀察HBV陽性肝癌患者癌組織中HBx與Mcl-1表達(dá)的相關(guān)性。 【結(jié)果】 1．HBx明顯增強(qiáng)細(xì)胞對氧化應(yīng)激信號誘導(dǎo)凋亡的敏感性，在此過程中伴隨Mcl-1蛋白水平的下調(diào)；且HBx能劑量依賴性的及時

7、間依賴性的下調(diào)Mcl-1蛋白，并不受細(xì)胞系的影響； 2．HBx下調(diào)Mcl-1蛋白主要發(fā)生在翻譯后水平； 3．過表達(dá)Mcl-1顯著抑制HBx的促凋亡作用； 4．HBx主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，激活caspas-3進(jìn)而加速降解Mcl-1蛋白實(shí)現(xiàn)其促凋亡作用的； 5．HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟缺血再灌注處理后肝組織中Mcl-1蛋白水平下降，同時伴隨肝細(xì)胞凋亡明顯增加； 6．HBV陽性肝癌患者癌組織中M

8、cl-1與HBx的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)。 【結(jié)論】 本研究發(fā)現(xiàn)HBx增強(qiáng)肝細(xì)胞對氧化應(yīng)激信號誘導(dǎo)凋亡的敏感性主要通過顯著增加胞內(nèi)ROS，活化caspas-3進(jìn)而加速M(fèi)cl-1蛋白降解來實(shí)現(xiàn)。提示ROS/caspase-3/Mcl-1途徑在HBx促肝細(xì)胞凋亡的過程中可能發(fā)揮重要作用。 第二部分：Mcl-1參與游離脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究 【研究背景和目的】 大量研究表明非酒精性脂肪肝是與肥胖、

9、Ⅱ型糖尿病、高脂血癥以及代謝綜合征等疾病病程進(jìn)展密切相關(guān)的代謝性疾病。近年來由于生活方式、飲食結(jié)構(gòu)等的改變，非酒精性脂肪肝的發(fā)病率不斷增加，目前已成為全世界范圍內(nèi)最常見的肝臟疾病，越來越受到人們的重視。然而，由于非酒精性脂肪肝的病因非常復(fù)雜，導(dǎo)致至今仍不清楚其確切的發(fā)病機(jī)制，因而也缺乏有效的治療手段。 游離脂肪酸是肝臟甘油三脂的主要來源，目前認(rèn)為游離脂肪酸是引起肝臟脂毒性的重要介質(zhì)，并在非酒精性脂肪肝的發(fā)病和病程進(jìn)展中具有重要作

10、用。研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝病理學(xué)的重要特點(diǎn)是肝臟細(xì)胞凋亡顯著增加。然而，對于游離脂肪酸如何誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的具體機(jī)制目前不十分清楚，仍有待進(jìn)一步研究。 近年來研究表明，Bcl-2家族中的Mcl-1作為其家族中一個重要的抗凋亡成員，在肝細(xì)胞的生存與凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，然而Mcl-1是否參與游離脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡并在其中發(fā)揮重要作用目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。 本實(shí)驗(yàn)首先觀察游離脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡過程中Mcl-1表

11、達(dá)的改變，然后結(jié)合腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)及干擾技術(shù)，明確Mcl-1在游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，并進(jìn)一步闡明游離脂肪酸調(diào)節(jié)Mcl-1表達(dá)的分子機(jī)制。 【實(shí)驗(yàn)方法】 1．構(gòu)建干擾Mcl-1的腺病毒； 2．通過檢測caspase活性和Western blot技術(shù)明確游離脂肪酸對凋亡的影響； 3．Western blot實(shí)驗(yàn)檢測游離脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中Mcl-1蛋白水平的改變； 4．real-ti

12、me PCR技術(shù)檢測游離脂肪酸對Mcl-1轉(zhuǎn)錄水平的影響； 5．運(yùn)用腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)和干擾技術(shù)明確Mcl-1在游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的生物學(xué)功能； 6．結(jié)合通路抑制劑實(shí)驗(yàn)開展游離脂肪酸對Mcl-1表達(dá)調(diào)控的信號通路研究。 【結(jié)果】 1．游離脂肪酸中的軟脂酸可明顯誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡； 2．軟脂酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中Mcl-1的蛋白水平顯著下調(diào)； 3．軟脂酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡主要是由Mcl

13、-1所介導(dǎo)的； 4．軟脂酸主要在翻譯后水平促進(jìn)Mcl-1蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解； 5．抗氧化劑和caspase抑制劑均無法阻斷軟脂酸誘導(dǎo)的Mcl-1的下降； 6．JNK通路介導(dǎo)軟脂酸對Mcl-1的負(fù)向調(diào)節(jié)。 【結(jié)論】 本研究發(fā)現(xiàn)軟脂酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡過程中Mcl-1的蛋白水平顯著下調(diào)，并進(jìn)一步明確軟脂酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡主要是通過激活JNK通路、促進(jìn)Mcl-1下調(diào)實(shí)現(xiàn)的，提示JNK/Mcl-1途