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文檔簡介
1、目的:
IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的屬于 IL-12細胞因子家族的異源二聚體。它含有 EB病毒誘導(dǎo)的基因EBI3和IL-27 P35兩個亞基。IL-35具有直接抑制T細胞增殖的免疫抑制的潛力,并且能夠?qū)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-35的rIL35Treg細胞,正是由于IL-35如此強大的免疫抑制功能,并且已研究表明其不只是在T細胞中表達,在 B細胞,巨噬細胞,腫瘤細胞中均有表達,那么,在機體任何疾病發(fā)生的原因必然與免疫微環(huán)境的失調(diào)有關(guān),
2、正常的免疫微環(huán)境需要促炎及免疫抑制因子的相平衡,任何一方的失調(diào),即失平衡,必然引起疾病的發(fā)生,對于腫瘤來說,免疫微環(huán)境的改變不但可以成為其發(fā)生因素,在其發(fā)生之后,腫瘤細胞自身將會產(chǎn)生和分泌相關(guān)的細胞因子等來引起免疫微環(huán)境的進一步改變,于此之間的相互作用,必然引起腫瘤的進一步發(fā)生及發(fā)展?,F(xiàn)已證實IL-35參與多種疾病的形成過程,包括各種炎癥性疾病、冠狀動脈疾病和癌癥,在炎癥性及免疫性相關(guān)疾病中,例如類風濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘等均有相當多的研究報
3、道,但是在腫瘤中對IL-35的研究還很少,我們在前期工作中研究發(fā)現(xiàn)IL-35在胰腺癌組織中及細胞系內(nèi)均有高表達,因為胰腺癌是一個含有豐富間質(zhì)成分的實體瘤,在其中炎性細胞占有很大比重,巨噬細胞是其中的主要細胞亞群,雖然IL-35與T細胞的相關(guān)性已經(jīng)較為透徹,那么作為炎癥細胞重要參與者的巨噬細胞,還沒有過研究報道IL-35與之的相關(guān)性,本研究就在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)了IL-35的表達水平跟腫瘤中局部浸潤的單核/巨噬細胞數(shù)具有相關(guān)性,并且已經(jīng)有大
4、量研究證實了巨噬細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移、進展和血管生成等過程中是一個重要的調(diào)節(jié)因子,因此本文為進一步明確 IL-35招募單核/巨噬細胞的途徑進行研究,將會對腫瘤的研究進展起到極大的推動作用,并且為臨床的用藥提供新的可能。
內(nèi)容和方法:
一、胰腺導(dǎo)管腺癌中IL-35的表達及與局部浸潤單核巨噬細胞的關(guān)系
1.在組織水平的免疫組化染色中,請病理科專業(yè)人員對片子的染色程度進行評分,評級,最后結(jié)果輸入SPSS系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析
5、,得出IL-35的表達水平是否與局部浸潤單核巨噬細胞數(shù)就有相關(guān)性,并且統(tǒng)計單核巨噬細胞數(shù)的水平與患者的預(yù)后是否相關(guān)。
2.在癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)平臺,分析IL-35與單核細胞相關(guān)Marker的相關(guān)性,進一步可以在胰腺癌組織的mRNA水平證實IL-35與單核巨噬細胞的相關(guān)性;
二、探究IL-35招募單核/巨噬細胞的途徑
1.對過表達IL-35的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
6、進行測序結(jié)果分析,查看IL-35的表達升高能夠引起哪些與招募單核/巨噬細胞相關(guān)的趨化因子在基因水平的改變;
2.在 TCGA數(shù)據(jù)庫平臺進一步證實 IL-35與單核/巨噬細胞相關(guān)的趨化因子是否具有潛在可能的相關(guān)性;
3.利用qRT-PCR,Western-blot兩個實驗來驗證,在細胞mRNA及蛋白水平上IL35是否與單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子間存在潛在的關(guān)聯(lián)性;
4.如果IL-35與單核巨噬細胞相關(guān)的趨化因子
7、間存在相關(guān)性,那么證實在機制水平上,IL-35能夠調(diào)控相關(guān)趨化因子是必須的,因此,我們利用,IL-35重組蛋白的刺激,加入相關(guān)受體的阻斷,觀察趨化因子是否會跟隨發(fā)生相關(guān)的改變,即Western-blot來驗證IL-35促單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子分泌的分子機制;
5.為了確切得證實其相關(guān)性,那么需要證實在IL-35重組蛋白的刺激下,信號通路是否可以如何與趨化因子的啟動序列區(qū)域的開放閱讀框架相結(jié)合,因此用 CHIP來驗證 IL-3
8、5是否能夠和單核巨噬細胞相關(guān)趨化因子的啟動子區(qū)相結(jié)合,是其之間的調(diào)控更加明確。
三、體外功能實驗來驗證IL-35是通過相關(guān)趨化因子來對單核巨噬細胞產(chǎn)生的招募作用
1.在機制上走得通,但是必須通過體外功能實驗來進一步的確切,采用密度梯度離心法來分離得到外周血單個核細胞,再并用貼壁法對巨噬細胞進行純化,進行得到相對純化的巨噬細胞;
2.用Transwel實驗來驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系上清對單核巨噬細胞的招募作用,由于IL
9、-35的改變引起下游趨化因子的改變,那么會分泌到細胞的培養(yǎng)上清中,用氣來檢測對巨噬細胞的招募能力,并且對結(jié)果中巨噬細胞的數(shù)量進行統(tǒng)計,再進行統(tǒng)計分析,查看有無統(tǒng)計學(xué)意義。
四、體內(nèi)動物實驗來驗證IL-35通過相關(guān)趨化因子對單核巨噬細胞的招募作用。
1.小黑鼠皮下種植Pan02過表達及降表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系及選擇性去除相關(guān)趨化因子及單核細胞組;
2.密切觀察小鼠腫瘤大小及小鼠狀態(tài)的變化。
結(jié)果:
10、
一、1.免疫組化的結(jié)果顯示,在組織水平上IL-35的表達高低與局部浸潤的單核巨噬細胞數(shù)具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義,并且單核巨噬細胞的浸潤程度與患者的預(yù)后密切相關(guān),胰腺癌組織局部浸潤的單核巨噬細胞數(shù)增多能夠明顯降低患者的總生存期;2.在TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌組織mRNA水平,用熱圖的形式分析 IL-35兩個亞基與單核巨噬細胞的相關(guān)指標之間的相關(guān)性,能夠明顯發(fā)現(xiàn)IL-35的兩個亞基與 CD11b,CD68,CCR2等單核細胞相關(guān) M
11、arker具有很高相關(guān)性。
二、構(gòu)建了胰腺癌過表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(PANC-1,BxPC-3和Pan02)和降表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(MIA-paca-2,CFPAC-1和Pan02),并送去測序公司進行基因測序。1.過表達IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的測序結(jié)果表明在過表達IL-35后與對照組細胞相比其與趨化因子相關(guān)的基因(CCL20,CCL2,CCL5,CX3CX1)表達均明顯提高;2.TCGA數(shù)據(jù)分析表明IL-35兩個亞基
12、與CCL2,CCL5兩個趨化因子都具有很高的相關(guān)性;3.qRT-PCR,Western-blot在細胞水平從mRNA及蛋白兩個方面證實IL-35與CCL2及CCL5的相關(guān)性,結(jié)果證實IL-35與CCL5的相關(guān)性較明顯;4. Western-blot來驗證IL-35促CCL5分泌的分子機制是JAK-STAT通路,主要是STAT1和STAT4激活,磷酸化為P-STAT1和P-STAT4入核進行調(diào)控;5.CHIP進一步驗證在IL-35的刺激下
13、,P-STAT1和P-STAT4能否入核與CCL5的啟動子序列進行結(jié)合。
三、1.采用密度梯度離心法從外周血中獲得單個核細胞,進一步采用貼壁法對單個核細胞進行純化,來獲得相對較純的單核細胞;2.用Transwell證實IL-35通過促進PDAC分泌CCL5來招募單核巨噬細胞,并將結(jié)果進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計結(jié)果有意義。
四、動物的體內(nèi)實驗證實,IL-35的過表達能夠明顯促進腫瘤的生長,如果在過表達IL-35的基礎(chǔ)上阻斷CC
14、L5或者去除單核巨噬細胞,則瘤體的體積明顯縮小,流式檢測IL-35能夠明顯提高腫瘤內(nèi)浸潤的經(jīng)典單核巨噬細胞的數(shù)量,如果在過表達IL-35的基礎(chǔ)上阻斷了CCL5和去除單核巨噬細胞,則招募的經(jīng)典單核巨噬細胞數(shù)明顯下調(diào)。
結(jié)論:
眾所周知,巨噬細胞對于腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移具有重要作用,因此研究如何阻斷巨噬細胞被招募至腫瘤微環(huán)境局部將具有重要的研究價值,我們首先在組織水平IL-35的表達與局部浸潤的巨噬細胞數(shù)密切相關(guān),IL
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