腫瘤細(xì)胞與血小板相互作用促進(jìn)MMP-9分泌、Tenascin-C形成的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用越來(lái)越被認(rèn)為是一個(gè)影響腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素，腫瘤細(xì)胞可以分泌一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子激活細(xì)胞外基質(zhì)，反過(guò)來(lái)，微環(huán)境提供的信號(hào)又促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。目前研究認(rèn)為，當(dāng)腫瘤細(xì)胞存在于遠(yuǎn)處器官微血管系統(tǒng)時(shí)，它與血小板的聚集和微血栓的形成是密切相關(guān)的。一旦血小板被激活，血小板將釋放特定生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移形成。事實(shí)上，在許多試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，在腫瘤發(fā)生血行轉(zhuǎn)移過(guò)程中，血小板的作用是必不可少的

2、。然而，腫瘤細(xì)胞與血小板相互作用的精確分子機(jī)制仍然是不清楚的。
　　TN-C是一個(gè)復(fù)雜的多功能蛋白，它由一個(gè)N端tenascin適配區(qū)域，接著是14.5個(gè)類似表皮生長(zhǎng)因子(EGF)重復(fù)結(jié)構(gòu)域，可變的類似纖連蛋白Ⅲ型(FNⅢ)重復(fù)序列和C端類似纖連蛋白原的結(jié)構(gòu)域組成。TN-C可以直接通過(guò)細(xì)胞表面受體或間接的結(jié)合其他基質(zhì)蛋白影響腫瘤細(xì)胞行為，這將誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。纖維性TN-C(fTN-C)主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)(EC

3、M)，fTN-C基質(zhì)的形成需要基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的參與，在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮作用。MMPs是一群肽鏈內(nèi)切酶，它能降解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)ECM重塑。在以前的研究中已經(jīng)證實(shí)，MMP-2和MMP-9的過(guò)表達(dá)可以極大的增強(qiáng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。大多數(shù)研究表明，MMP-9和TN-C蛋白的過(guò)表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和不良的預(yù)后是相關(guān)的，但MMP-9和TN-C在胰腺癌中的作用仍不清楚。血小板能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，但是否是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌MMP-9

4、和TN-C來(lái)實(shí)現(xiàn)的，目前也是不清楚的。
　　CD44是一種表達(dá)癌癥表型的多功能細(xì)胞受體，CD44是一個(gè)單鏈，單程的跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于生理和病理系統(tǒng)。同時(shí)，CD44參與細(xì)胞粘附、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。在以前的研究中，CD44已經(jīng)被暗示能夠以依賴透明質(zhì)酸或不依賴透明質(zhì)酸的方式調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，主要是MMP-2和MMP-9。此外，在最近已有報(bào)道證實(shí)CD44在結(jié)腸癌細(xì)胞擁有selectin結(jié)合力，CD44是P-selectin配體。

5、P-selectin是一個(gè)重要的粘附受體，表達(dá)于激活的內(nèi)皮細(xì)胞上。與此同時(shí)，激活的血小板也表達(dá)P-selectin。所以我們可以假設(shè)腫瘤細(xì)胞與血小板之間的相互作用是通過(guò)CD44和P-selectin的粘附來(lái)完成的。
　　研究目的：
　　我們調(diào)查TN-C和MMP-9在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，分析MMP-9和TN-C表達(dá)和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。與此同時(shí)，我們?cè)谀[瘤細(xì)胞與血小板共培養(yǎng)體系中研究人類胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力。我們利用這個(gè)

6、共培養(yǎng)系統(tǒng)，探測(cè)MMP-9和TN-C的表達(dá)水平。此外，我們進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞與血小板相互作用是否是通過(guò)CD44和P-selectin的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　研究方法：
　　1.共收集了103例在第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽外科研究所接受手術(shù)治療的患者，從2007年1月至2010年6月的胰腺癌患者。所有患者接受根治性胰十二直腸切除術(shù)或保留幽門的胰十二直腸切除術(shù)，并做淋巴結(jié)清掃。沒(méi)有一個(gè)病人接受了新輔助療法和輔助放化療。石蠟包埋切片樣

7、本用來(lái)做免疫組織化學(xué)分析。所有患者在術(shù)后3個(gè)月行超聲波、放射X線及計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查，探測(cè)到有新病變被認(rèn)為是復(fù)發(fā)，平均隨訪期為13個(gè)月（范圍3-49個(gè)月）。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法調(diào)查TN-C和MMP-9在胰腺癌組織的表達(dá)水平，分析單表達(dá)和共表達(dá)這兩個(gè)分子和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并分析其與胰腺癌病人生存預(yù)后的相關(guān)性。
　　2.人類胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPcl和BxPc3。這些細(xì)胞系是購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。這些細(xì)胞在含10％胎牛血清的R

8、PMI1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，他們被保持在37℃的含有5％的二氧化碳環(huán)境中。與血小板共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞被播種在六孔板中，孵育過(guò)夜，立即更換新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入100μl1×108/毫升的純血小板，培養(yǎng)至少48小時(shí)。為了探測(cè)血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響，我們?cè)诠才囵B(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。條件培養(yǎng)基被收集來(lái)做明膠酶譜分析(Gelatinzymography)，提取培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Bl

9、otting)。
　　3.在細(xì)胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)，我們使用特異性抗體封閉血小板P-selectin，并使用小干擾RNA(siRNA)敲掉BxPc3細(xì)胞的CD44，然后通過(guò)明膠酶譜分析(Gelatinzymography)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blotting)的方法探測(cè)MMP-9的表達(dá)和TN-C的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.我們?cè)?03例胰腺癌組織中檢測(cè)了TN-C和MMP-9的表達(dá)水平，分析了單表達(dá)和共表

10、達(dá)這兩個(gè)分子和胰腺癌患者的臨床病理參數(shù)及生存預(yù)后的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中，MMP-9和TN-C的表達(dá)水平是明顯增加的。MMP-9和TN-C的共表達(dá)也是存在的。臨床統(tǒng)計(jì)分析表明，MMP-9，TN-C和纖維TN-C(fTN-C)的表達(dá)水平與血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和TNM分期是相關(guān)的。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9和TN-C的共表達(dá)與胰腺腺癌轉(zhuǎn)移是顯著相關(guān)的。生存分析顯示，MMP-9或TN-C的單表達(dá)明顯降低胰腺癌患者的總生存率

11、，共表達(dá)MMP-9和TN-C的胰腺癌患者具有最低的總生存率。
　　2.為了確定血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，我們?cè)谘“搴鸵认侔┘?xì)胞共培養(yǎng)體系中檢測(cè)了MMP-9和TN-C的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的AsPcl和BxPc3細(xì)胞培養(yǎng)相比，在血小板與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的能力是明顯增加的，MMP-9和TN-C蛋白表達(dá)水平是增加的，尤其是小分質(zhì)量TN-C片段。同時(shí)，MMP-9的活性也是明顯增強(qiáng)的，尤其是BxPc3細(xì)胞。

12、r>　　3.為了探索腫瘤細(xì)胞與血小板相互作用的分子機(jī)制，我們?cè)谘“迮cBxPc3共培養(yǎng)體系中用特異性抗體封閉血小板P-selectin，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9活性降低，MMP-9和TN-C蛋白表達(dá)水平也降低。我們用小干擾RNA(siRNA)敲掉BxPc3細(xì)胞的CD44，然后與血小板進(jìn)行共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9活性也是降低的，MMP-9和TN-C蛋白表達(dá)水平也明顯降低。
　　討論：
　　1.MMP-9和TN-C的共表達(dá)可能促進(jìn)腫