腫瘤細胞與血小板相互作用促進MMP-9分泌、Tenascin-C形成的分子機制.pdf

1、研究背景：
　　腫瘤細胞與微環(huán)境之間的相互作用越來越被認為是一個影響腫瘤惡性進展的重要因素，腫瘤細胞可以分泌一些生長因子和細胞因子激活細胞外基質(zhì)，反過來，微環(huán)境提供的信號又促進腫瘤細胞侵襲和轉移。目前研究認為，當腫瘤細胞存在于遠處器官微血管系統(tǒng)時，它與血小板的聚集和微血栓的形成是密切相關的。一旦血小板被激活，血小板將釋放特定生長因子，促進腫瘤轉移形成。事實上，在許多試驗中已經(jīng)證實，在腫瘤發(fā)生血行轉移過程中，血小板的作用是必不可少的

2、。然而，腫瘤細胞與血小板相互作用的精確分子機制仍然是不清楚的。
　　TN-C是一個復雜的多功能蛋白，它由一個N端tenascin適配區(qū)域，接著是14.5個類似表皮生長因子(EGF)重復結構域，可變的類似纖連蛋白Ⅲ型(FNⅢ)重復序列和C端類似纖連蛋白原的結構域組成。TN-C可以直接通過細胞表面受體或間接的結合其他基質(zhì)蛋白影響腫瘤細胞行為，這將誘導血管生成和促進腫瘤細胞遷移。纖維性TN-C(fTN-C)主要表達于腫瘤細胞外基質(zhì)(EC

3、M)，fTN-C基質(zhì)的形成需要基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的參與，在促進腫瘤轉移中可能發(fā)揮作用。MMPs是一群肽鏈內(nèi)切酶，它能降解細胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)ECM重塑。在以前的研究中已經(jīng)證實，MMP-2和MMP-9的過表達可以極大的增強腫瘤的侵襲轉移潛能。大多數(shù)研究表明，MMP-9和TN-C蛋白的過表達與腫瘤的進展和不良的預后是相關的，但MMP-9和TN-C在胰腺癌中的作用仍不清楚。血小板能促進腫瘤轉移的形成，但是否是通過促進腫瘤細胞分泌MMP-9

4、和TN-C來實現(xiàn)的，目前也是不清楚的。
　　CD44是一種表達癌癥表型的多功能細胞受體，CD44是一個單鏈，單程的跨膜糖蛋白，廣泛表達于生理和病理系統(tǒng)。同時，CD44參與細胞粘附、腫瘤侵襲和轉移。在以前的研究中，CD44已經(jīng)被暗示能夠以依賴透明質(zhì)酸或不依賴透明質(zhì)酸的方式調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，主要是MMP-2和MMP-9。此外，在最近已有報道證實CD44在結腸癌細胞擁有selectin結合力，CD44是P-selectin配體。

5、P-selectin是一個重要的粘附受體，表達于激活的內(nèi)皮細胞上。與此同時，激活的血小板也表達P-selectin。所以我們可以假設腫瘤細胞與血小板之間的相互作用是通過CD44和P-selectin的粘附來完成的。
　　研究目的：
　　我們調(diào)查TN-C和MMP-9在胰腺癌組織中的表達情況，分析MMP-9和TN-C表達和臨床病理參數(shù)的相關性。與此同時，我們在腫瘤細胞與血小板共培養(yǎng)體系中研究人類胰腺癌細胞的侵襲能力。我們利用這個

6、共培養(yǎng)系統(tǒng)，探測MMP-9和TN-C的表達水平。此外，我們進一步研究腫瘤細胞與血小板相互作用是否是通過CD44和P-selectin的結合來實現(xiàn)的。
　　研究方法：
　　1.共收集了103例在第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院肝膽外科研究所接受手術治療的患者，從2007年1月至2010年6月的胰腺癌患者。所有患者接受根治性胰十二直腸切除術或保留幽門的胰十二直腸切除術，并做淋巴結清掃。沒有一個病人接受了新輔助療法和輔助放化療。石蠟包埋切片樣

7、本用來做免疫組織化學分析。所有患者在術后3個月行超聲波、放射X線及計算機斷層掃描檢查，探測到有新病變被認為是復發(fā)，平均隨訪期為13個月（范圍3-49個月）。我們通過免疫組織化學的方法調(diào)查TN-C和MMP-9在胰腺癌組織的表達水平，分析單表達和共表達這兩個分子和臨床病理參數(shù)的相關性，并分析其與胰腺癌病人生存預后的相關性。
　　2.人類胰腺癌細胞系AsPcl和BxPc3。這些細胞系是購自美國ATCC公司。這些細胞在含10％胎牛血清的R

8、PMI1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，他們被保持在37℃的含有5％的二氧化碳環(huán)境中。與血小板共培養(yǎng)體系中，細胞被播種在六孔板中，孵育過夜，立即更換新鮮的無血清培養(yǎng)基。加入100μl1×108/毫升的純血小板，培養(yǎng)至少48小時。為了探測血小板對腫瘤細胞侵襲的影響，我們在共培養(yǎng)系統(tǒng)進行transwell侵襲實驗。條件培養(yǎng)基被收集來做明膠酶譜分析(Gelatinzymography)，提取培養(yǎng)細胞的蛋白質(zhì)用于免疫印跡實驗(Western Bl

9、otting)。
　　3.在細胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)，我們使用特異性抗體封閉血小板P-selectin，并使用小干擾RNA(siRNA)敲掉BxPc3細胞的CD44，然后通過明膠酶譜分析(Gelatinzymography)和免疫印跡實驗(Western Blotting)的方法探測MMP-9的表達和TN-C的表達。
　　研究結果：
　　1.我們在103例胰腺癌組織中檢測了TN-C和MMP-9的表達水平，分析了單表達和共表

10、達這兩個分子和胰腺癌患者的臨床病理參數(shù)及生存預后的相關性。我們發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中，MMP-9和TN-C的表達水平是明顯增加的。MMP-9和TN-C的共表達也是存在的。臨床統(tǒng)計分析表明，MMP-9，TN-C和纖維TN-C(fTN-C)的表達水平與血管侵犯、淋巴結轉移、肝轉移和TNM分期是相關的。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9和TN-C的共表達與胰腺腺癌轉移是顯著相關的。生存分析顯示，MMP-9或TN-C的單表達明顯降低胰腺癌患者的總生存率

11、，共表達MMP-9和TN-C的胰腺癌患者具有最低的總生存率。
　　2.為了確定血小板對腫瘤細胞的影響，我們在血小板和胰腺癌細胞共培養(yǎng)體系中檢測了MMP-9和TN-C的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)，與單獨的AsPcl和BxPc3細胞培養(yǎng)相比，在血小板與腫瘤細胞共培養(yǎng)體系中，腫瘤細胞穿透基底膜的能力是明顯增加的，MMP-9和TN-C蛋白表達水平是增加的，尤其是小分質(zhì)量TN-C片段。同時，MMP-9的活性也是明顯增強的，尤其是BxPc3細胞。

12、r>　　3.為了探索腫瘤細胞與血小板相互作用的分子機制，我們在血小板與BxPc3共培養(yǎng)體系中用特異性抗體封閉血小板P-selectin，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9活性降低，MMP-9和TN-C蛋白表達水平也降低。我們用小干擾RNA(siRNA)敲掉BxPc3細胞的CD44，然后與血小板進行共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9活性也是降低的，MMP-9和TN-C蛋白表達水平也明顯降低。
　　討論：
　　1.MMP-9和TN-C的共表達可能促進腫