H型高血壓大鼠腦損傷免疫機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的：（1）研究不同種屬、不同干預(yù)方式、不同時(shí)間點(diǎn)大鼠體重、血壓以及血漿Hcy水平；（2）檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿細(xì)胞因子水平、腦組織相關(guān)基因mRNA、蛋白以及腦組織病理學(xué)檢測(cè)；（3）檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)WKY-C/M/T及SHR-C/M/T外周血Th17、Treg淋巴細(xì)胞比例；（4）觀察大鼠頭顱MRI影像學(xué)改變。
　　研究?jī)?nèi)容與方法：（1）將60只SHR、60只WKY按照隨機(jī)分配的原則分為6組， SHR-C組、SHR-M以及SHR-

2、T組，WKY-C組、WKY-M組以及WKY-T組，每組20只，C組給予普通飼料16周、M組給予添加2％蛋氨酸16周、T組給予添加2%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)8周，自第9周第1天給予VitB120.09mg/kg/d、葉酸4mg/kg/d、VitB612mg/kg/d灌胃治療，共計(jì)16周，并在分別于試驗(yàn)開(kāi)始第一天（0周）、第4周、第8周、第12周、第16周測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，應(yīng)用無(wú)創(chuàng)鼠尾測(cè)壓法測(cè)量大鼠SBP，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)大鼠血漿Hcy水平；

3、（2）分別于試驗(yàn)第8周、第12周、第16周應(yīng)用ELISA法檢測(cè)大鼠血漿細(xì)胞因子IL-17、IL-10、TGF-β、IL-6水平，于試驗(yàn)第8周、第12周、第16周應(yīng)用PCR法檢測(cè)大鼠腦組織IL-10、IL-17、Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)，第16周應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)大鼠腦組織Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)，于試驗(yàn)第16周處死大鼠，進(jìn)行腦組織病理學(xué)觀察；（3）分別于試驗(yàn)的第0周、第4周、第8周、第12周及第16周應(yīng)

4、用Beckman Cytomics FC500流式細(xì)胞儀對(duì)WKY-C/M/T及SHR-C/M/T組大鼠外周血Th17、Treg淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析；（4）應(yīng)用Bruker7.0T高場(chǎng)強(qiáng)小動(dòng)物核磁共振掃描儀對(duì)24周齡WKY-C/M/T及SHR-C/M/T進(jìn)行頭顱常規(guī)MRI檢測(cè)。
　　結(jié)果：（1）試驗(yàn)16周內(nèi)無(wú)論WKY還是SHR，體重都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，以WKY-C最為明顯，高蛋氨酸飲食能夠使體重生長(zhǎng)減緩，而葉酸和維生素B飲食對(duì)高蛋氨酸飲食導(dǎo)

5、致的體重減緩影響不大；SHR-C/M/T3組大鼠的SBP和血漿Hcy水平明顯高于WKY-C/M/T3組，蛋氨酸干預(yù)的M組和T組明顯高于正常飲食的C組，經(jīng)過(guò)葉酸和VitB6、VitB12聯(lián)合治療后的T組低于同時(shí)期M組血壓，并且這種差異在第8周之后更加顯著；（2）WKY組的IL-6水平保持不變，并且WKY-C、WKY-M和WKY-T沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SHR-C組IL-6水平持續(xù)上升，SHR-T組的IL-6水平持續(xù)下降，第12周，SHR-M組顯

6、著高于SHR-T組，第16周，SHR-M組顯著高于SHR-C組和SHR-T組，第12和16周SHR組和WKY組的IL-6水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WKY-M組的IL-17水平持續(xù)上升，在第16周顯著高于WKY-C組和WKY-T組，SHR-C組和SHR-M組IL-17水平呈上升趨勢(shì)，SHR-M組上升更快，SHR-T組先稍微上升后下降，在12周達(dá)到最高水平47.55 pg/ml。WKY-C、SHR-C組IL-10基本保持不變，WKY-M、SHR-

7、M組IL-10持續(xù)下降，且SHR組下降較迅速；WKY-T、SHR-T組IL-10不斷上升，且SHR組上升較快，在第16周，WKY-M、SHR-M IL-10均低于同種屬C組和T組，且這種差異SHR組更明顯。8-16周，WKY-C組和SHR-C組血清中TGF-β保持不變，WKY-M組和SHR-M組TGF-β緩慢下降，WKY-T組和SHR-T組TGF-β緩慢上升，在第16周，無(wú)論大鼠WKY組還是高血壓大鼠SHR組， M組TGF-β都顯著低于

8、C組和T組。WKY-C組和SHR-C組RORγt mRNA水平基本保持不變，WKY-M組和SHR-M組RORγt mRNA水平持續(xù)上升，SHR組-M上升較迅速，WKY-T組和SHR-T組RORγt mRNA不斷下降，SHR-T組下降較快；WKY-C組和SHR-C組IL-17 mRNA水平基本保持不變，WKY-M組和SHR-M組IL-17 mRNA水平持續(xù)上升，SHR-M組上升較迅速，WKY-T組和SHR-T組IL-17 mRNA不斷下降

9、，12周之后下降速度減緩，SHR-T組下降較快；WKY-C組、SHR-C組、WKY-M組和SHR-M組Foxp3 mRNA水平基本保持不變，WKY-T組Foxp3 mRNA水平持續(xù)上升，SHR-T組Foxp3的mRNA水平先迅速上升后下降，第12周達(dá)到峰值。WKY-C組、WKY-M組、WKY-T組、SHR-C組和SHR-M組IL-10mRNA水平基本不變， SHR-T組先迅速上升后迅速下降，第12周達(dá)到峰值，且顯著高于SHR-C組和SH

10、R-T組。WKY和SHR腦組織中，RORγt在C組和T組水平較高，M組表達(dá)較低，F(xiàn)oxp3的表達(dá)情況恰恰相反，在C組和T組水平較低， M組表達(dá)較高。病理組織染色顯示，WKY-M組Th17陽(yáng)性細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)WKY-C組，經(jīng)過(guò)葉酸和維生素B治療后WKY-T組Th17陽(yáng)性細(xì)胞減少，與WKY-C組基本持平， WKY-M組Treg陽(yáng)性細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組WKY-C組，經(jīng)過(guò)葉酸和維生素B治療后WKY-T組Treg陽(yáng)性細(xì)胞增多，但是仍然少于WKY-C組

11、；SHR組Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞變化趨勢(shì)WKY相似，WKY-M組和SHR-M組部分區(qū)域血管輕度增生，SHR-M組部分區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞增多， WKY-M組部分區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞減少甚至萎縮。結(jié)論 Hcy的致病作用在mRNA水平、蛋白水平、血漿水平、組織水平均得到證實(shí)，且經(jīng)葉酸、VB族治療后，其致病作用呈現(xiàn)出減弱趨勢(shì)；（3）0周到第16周，WKY-C及SHR-C組Tregs細(xì)胞逐漸升高， WKY-M及SHR-M組Tregs細(xì)胞例逐漸下降，WKY-

12、T及SHR-T組Tregs細(xì)胞出現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)（第8周為轉(zhuǎn)折點(diǎn)）；而WKY-C及SHR-C組Th17細(xì)胞逐漸降低，WKY-M及SHR-M組Th17細(xì)胞逐漸升高，WKY-T及SHR-T組Th17細(xì)胞呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢(shì)；（4）6組共計(jì)24只24周齡大鼠均未出現(xiàn)明顯缺血性腦病表現(xiàn)。
　　結(jié)論：（1）高蛋氨酸飲食可以成功造成大鼠血漿Hcy水平升高，以SHR升高為著，同時(shí)HHcy可以造成不同中屬于大鼠血壓升高，經(jīng)葉酸和VitB6、V

13、itB12聯(lián)合治療后可降低血漿Hcy水平同時(shí)起到降低血壓的作用；（2）Hcy的致病作用在mRNA水平、蛋白水平、血漿水平、組織水平均得到證實(shí)，且經(jīng)葉酸、VB族治療后，其致病作用呈現(xiàn)出減弱趨勢(shì)；（3）高蛋氨酸可造成大鼠外周血Tregs細(xì)胞比例下降，Th17細(xì)胞比例升高，經(jīng)葉酸、VitB6及VitB12聯(lián)合治療干預(yù)后， Hcy的作用減弱，是Tregs細(xì)胞比例升高、Th17細(xì)胞比例下降；（4）24周齡WKY/SHR大鼠并未出現(xiàn)缺血性腦血管病表