黃等中小分子化合物對雌激素缺乏骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　骨質(zhì)疏松是一種全身代謝性的骨骼疾病，表現(xiàn)為骨量減少、骨小梁喪失、骨皮質(zhì)變薄、骨的微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而導(dǎo)致骨脆性增加，骨折發(fā)生率增高[1]。目前，全球已有超過2億人口被骨質(zhì)疏松疾病所困擾。骨質(zhì)疏松分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性所占比例較高，高達(dá)85％-90%，又可以分為女性絕經(jīng)后由雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，以及年齡相關(guān)性的骨質(zhì)疏松；而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由一些內(nèi)分泌性疾病和肝腎疾病等所導(dǎo)致的[2]?？傮w來說骨質(zhì)疏松更

2、易發(fā)生在絕經(jīng)之后雌激素分泌減少的婦女[3]。骨質(zhì)疏松會隨著病程表現(xiàn)出一系列臨床癥狀如疼痛、骨長度的減少、骨折、呼吸功能的減低等等。以往臨床上常用來治療骨質(zhì)疏松的藥物主要是雌激素替代物、二磷酸鹽、甲狀旁腺素片段、降鈣素、鈣制劑和維生素D，而前四種藥物不同程度地存在副作用，比如引起乳腺腫瘤、骨壞死、心血管疾病等，后兩種藥物必須同時運用，而且藥效有限[4]。因此，目前亟需一種安全、有效的骨質(zhì)疏松治療方法[5]。中醫(yī)文化博大精深，人們也一直在探

3、索嘗試用中藥來治療骨質(zhì)疏松，因其更強調(diào)一個整體的概念，能夠調(diào)動內(nèi)因，而作用于機(jī)體相關(guān)聯(lián)的多個環(huán)節(jié)。已有研究表明，中藥治療骨質(zhì)疏松的核心在于其中所含的天然多糖成分[6]。黃芩是一種在中國運用歷史已久的傳統(tǒng)中藥，含有豐富的黃酮類化合物，研究較多的有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等等[7]，以往關(guān)于黃芩藥理的研究主要集中在抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及心血管保護(hù)等活性上，而對于抗骨質(zhì)疏松方面的相關(guān)研究較少。
　　研究目的：

4、　　在大鼠去勢骨質(zhì)疏松模型中，探索黃芩提取物腹腔注射能否預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生，能否減緩/逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松中的骨喪失，并進(jìn)一步探索黃芩提取物對BMMSCs的影響
　　研究方法：
　　1.黃芩小分子化合物的分離提取。從干燥的黃芩根莖中依次用95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯萃取，冷凍干燥后過篩得到80目細(xì)粉。
　　2.黃芩提取物中黃酮類化合物含量測定。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算黃酮類含量的百分比。
　　3.黃芩提取物穩(wěn)定性測

5、試。采用色譜分析法，將黃芩提取物溶液在80℃條件下加熱，檢測其在2小時內(nèi)的熱穩(wěn)定性；將黃芩提取物溶液在3個月內(nèi)的間隔時間節(jié)點加熱，檢測其在3個月內(nèi)的加速穩(wěn)定性。
　　4.黃芩提取物眼及皮膚刺激性測試。以新西蘭白兔為受試對象，以一定濃度的黃芩提取物的丁二醇溶液滴眼，對側(cè)眼為自身空白對照，按照眼損害的評分標(biāo)準(zhǔn)計分后評估其眼刺激性。以一定濃度的黃芩提取物的丁二醇溶液涂抹皮膚，按皮膚刺激反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)計分后評估其皮膚刺激性。
　　5

6、.黃芩提取物毒性測試。以小鼠為受試對象，將一定劑量黃芩提取物予以灌胃。觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，按照經(jīng)口毒性分級評價其毒性。
　　6.黃芩提取物對大鼠雌激素缺乏骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。篩選適宜的濃度后，在雌性大鼠去勢骨質(zhì)疏松模型中，預(yù)防組從去勢后1周內(nèi)開始給予腹腔注射，治療組從去勢2月后開始腹腔注射。頻率為2次/周，周期共計12周，分別在第6和12周末Micro CT掃描一側(cè)股骨，比較骨量和骨小梁數(shù)目差異，評價黃芩提取物對骨

7、質(zhì)疏松的預(yù)防和治療作用。
　　7.黃芩提取物對BMMSCs的作用。培養(yǎng)各組大鼠的BMMSCs,比較其增殖和分化能力的不同：向培養(yǎng)液中加入一定濃度黃芩提取物，檢測其對BMMSCs增殖和成骨分化的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.黃芩提取物是一種黃色有特殊氣味的固體粉末，可溶于丙二醇、丁二醇等有機(jī)溶劑，易溶于二甲基亞砜。
　　2.黃芩提取物中黃酮類化合物含量較豐富，約為10%。
　　3.黃芩提取物穩(wěn)定性較好，可承

8、受80℃高溫達(dá)2h，并在3個月內(nèi)相對穩(wěn)定。
　　4.黃芩提取物250mg/mr濃度滴眼后lh個別動物出現(xiàn)輕微充血，但在24h、48h和72h，未見分泌物及水腫等現(xiàn)象，角結(jié)膜無異常，其無眼刺激性。以25mg/ml多次涂抹皮膚刺激后，有輕微紅斑，無水腫，其無皮膚刺激性。
　　5.將黃芩提取物以5000mg/kg劑量灌胃之后24 h內(nèi)死亡一只動物，死亡率為10%,在安全范圍內(nèi)；其余存活動物精神狀態(tài)較好、行為無異常，且體重正常增長，

9、表明其安全無毒性。
　　6.黃芩提取物腹腔注射后，Micro CT結(jié)果顯示預(yù)防和治療組的給藥動物骨量和骨小梁數(shù)目相比對照組都有所增加，但只是一定程度上減緩骨喪失、部分恢復(fù)骨量。
　　7.以黃芩提取物刺激BMMSCs后MTT曲線和克隆形成率均顯示其對BMMSCs的增殖有促進(jìn)作用，成骨誘導(dǎo)后ALP染色和茜素紅染色顯示SGB-E刺激后ALP含量增加，礦化結(jié)節(jié)形成也較多，同時成骨相關(guān)基因表達(dá)增多，其對BMMSCs的成骨分化也有促進(jìn)作