Zmp1對(duì)分枝桿菌抗原PPE68-PPE68肽免疫原性的影響.pdf

1、目的：
　　1.篩選Mtb的PPE68基因中有效的抗原肽（簡(jiǎn)稱PPE68肽），構(gòu)建帶有PPE68肽的真核質(zhì)粒pBudCE4.1-PPE68肽，以沙門菌為載體，灌胃免疫BALB／c小鼠，觀察PPE68及PPE68肽的免疫原性差異。
　　2.構(gòu)建 Zmp1與 PPE68或 PPE68肽的共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-PPE68-Zmp1和pBudCE4.1-PPE68肽-Zmp1，以沙門菌為載體，灌胃免疫BALB／c小鼠，探討Z

2、mp1對(duì)PPE68及PPE68肽的免疫原性的影響。
　　方法：
　　1.在GenBank查找PPE68基因序列（NC_000962）和抗原蛋白編碼序列，經(jīng)在線抗原肽分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/Services/BepiPre d/)篩查 T細(xì)胞抗原表位，合成編碼抗原肽的編碼序列，構(gòu)建pBudCE4.1-PPE68肽表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.將pBudCE4.1-PPE68和pBudCE4.1-PPE

3、68肽重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入減毒沙門菌SL7207中，通過(guò)PCR鑒定重組沙門菌；用鑒定正確的重組沙門菌口服免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況、血清IL-12與IFN-γ水平，腸及肺粘膜sIgA產(chǎn)生來(lái)了解PPE68及PPE68抗原肽的免疫原性。
　　3.將Zmp1基因插入到pBudCE4.1-PPE68和pBudCE4.1-PPE68肽質(zhì)粒另一個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建 pBudCE4.1-PPE68-Zmp1和pBudCE4.1-PPE

4、68肽-Zmp1質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)Zmp1基因mRNA的表達(dá)水平。
　　4.將pBudCE4.1-PPE68-Zmp1和pBudCE4.1-PPE68肽-Zmp1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入減毒沙門菌 SL7207，構(gòu)建重組沙門菌，口服免疫 BALB／c小鼠，檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況、血清 IL-12與 IFN-γ水平，腸及肺粘膜sIgA產(chǎn)生來(lái)探討Zmp1對(duì)PPE68或PPE68抗原肽免疫原性的

5、影響。
　　結(jié)果：
　　1.篩選出PPE68抗原肽，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBudCE4.1-PPE68肽經(jīng)PCR鑒定正確，DNA測(cè)序結(jié)果完全正確。
　　2.重組質(zhì)粒pBudCE4.1-PPE68和pBudCE4.1-PPE68肽電轉(zhuǎn)入減毒沙門菌，經(jīng)PCR鑒定，成功構(gòu)建重組沙門菌。
　　3.末次免疫小鼠后，ELISA法檢測(cè)血清中IL-12和IFN-γ。PPE68組與PPE68肽組IL-12和IFN-γ均高于對(duì)照組(P＜

6、0.05)，PPE68肽組高于PPE68組(P＜0.05)；與對(duì)照組相比，PPE68組與PPE68肽組特異性脾淋巴細(xì)胞增殖均有顯著性差異(P＜0.05)；與對(duì)照組相比，PPE68組與PPE68肽組的小腸灌洗液和肺灌洗液中sIgA升高水平有顯著性差異(P＜0.05)，但PPE68組與PPE68肽組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　4.成功構(gòu)建質(zhì)粒pBudCE4.1-PPE68-Zmp1和 pBudCE4.1-PPE68肽-Zmp1

7、，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切，出現(xiàn)條帶與理論值相符合，DNA雙向測(cè)序結(jié)果與GenBank中錄注的序列相同；qRT-PCR檢測(cè)到Zmp1基因在巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)mRNA表達(dá)。
　　5.重組質(zhì)粒 pBudCE4.1-PPE68-Zmp1和 pBudCE4.1-PPE68肽-Zmp1電轉(zhuǎn)入沙門菌，經(jīng)PCR鑒定，成功構(gòu)建了重組沙門菌。
　　6.口服免疫小鼠，ELISA檢測(cè)血清中IL-12和IFN-γ。血清中IL-12的水平 PPE68組

8、和 PPE68/Zmp1組相比較有差異（P＜0.05），PPE68肽組和PPE68肽/Zmp1組相比較有顯著性差異（P＜0.05）。血清中INF-γ的水平PPE68組和PPE68/Zmp1組相比較有顯著性差異（P＜0.05）， PPE68肽組和PPE68肽/Zmp1組相比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。小腸灌洗液中 sIgA的水平 PPE68組和 PPE68/Zmp1組相比較有差異，（P＜0.05）；PPE68肽組和 PPE68肽/Zm

9、p1組相比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。肺灌洗液中sIgA的水平PPE68組和PPE68/Zmp1組相比較有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PPE68肽組和PPE68肽/Zmp1組相比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比有顯著性差異（P＜0.05），但實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)減毒沙門菌攜帶，PPE68和PPE68抗原肽均能誘導(dǎo)明顯的免疫應(yīng)答；采用PPE6