銀杏內(nèi)酯B對神經(jīng)干細胞分化的影響及其機制研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復是康復醫(yī)學的熱點和難點。在成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害性疾病中，腦血管疾病的比例當居首位，其次為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、顱腦和脊髓損傷等。各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷雖病因各異，但病理上均有中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位、不同程度的神經(jīng)元缺失和結(jié)構(gòu)功能異常。神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)廣泛存在的具有自我更新、自我增殖能力和多種分化潛能的特殊

2、細胞群。神經(jīng)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷近年來受到了廣泛的關(guān)注，可達到修復神經(jīng)通路以及重建神經(jīng)功能的目的，為臨床實踐帶來了希望。 目前認為，神經(jīng)干細胞增殖分化的機制十分復雜，受到正性和負性調(diào)節(jié)分子的調(diào)控。各種調(diào)控NSCs命運的信號分子是相互協(xié)同和依賴的，NSCs所具有的內(nèi)在分化程序、局部環(huán)境中的細胞因子、細胞外基質(zhì)、黏附分子、細胞間的相互作用等均與其增殖、分化密切關(guān)系。細胞因子的效應又受多種因子的調(diào)節(jié)，包括SOCS(Su

3、ppressors of cytokine signaling，細胞因子信號抑制因子)家族。 Id(lnhibitor of DNA Binding，DNA結(jié)合抑制因子)作為bHLH(Helix-loop-helix，堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子的負性調(diào)節(jié)子而起作用。Id2是Id家族成員之一，原位雜交顯示在腦和脊髓有廣泛表達，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著重要的功能，通過阻滯bHLH轉(zhuǎn)錄因子作用，抑制NSCs向神經(jīng)元分化。SOCS是近年來

4、發(fā)現(xiàn)的一類可被多種細胞因子誘導產(chǎn)生，包括多種細胞因子、生長因子和激素，并對細胞因子信號通路具有負反饋調(diào)節(jié)作用的蛋白分子。SOCS2是SOCS家族成員之一，SOCS2 mRNA在發(fā)育和成年動物神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達，主要限定在神經(jīng)元中表達。研究表明SOCS2是一種潛在的神經(jīng)分化調(diào)控因子，在控制神經(jīng)細胞分化和決定細胞命運方面起重要作用，能促進NSCs向神經(jīng)元方向分化，促進神經(jīng)突起生長，對神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能均具有重要作用。 目前國內(nèi)外神經(jīng)

5、干細胞的增殖及定向分化研究，多關(guān)注細胞因子對NSCs的影響。中醫(yī)藥是我國的“國粹”，在神經(jīng)康復的實驗研究和臨床應用中具有巨大潛力。因此應用中藥誘導NSCs的增殖和分化，促進神經(jīng)再生和神經(jīng)功能的修復與重建，可望為中藥治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷開辟重要的治療途徑。但中醫(yī)藥對神經(jīng)干細胞增殖分化的研究多局限于現(xiàn)象觀察，缺乏深入的機制研究。銀杏(Ginkgo bilobo)是一古老而神奇的植物，有“活化石”之稱。銀杏萜內(nèi)酯為銀杏葉提取物(EGb，

6、extract of ginkgo bilobo)的主要有效成分，其中銀杏內(nèi)酯B(GKB，Ginkgolide B)含量最多，且抗人體血小板活化因子(PAF)作用最為強大。有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能促進周圍神經(jīng)再生，GKB具有促進NSCs分化的作用，但其作用機制仍不清楚，進一步闡明其調(diào)控機制對中醫(yī)藥在神經(jīng)修復領(lǐng)域深層次研究開辟思路。 目的：探討銀杏內(nèi)酯B對神經(jīng)干細胞分化的影響及其作用機制，為GKB應用于神經(jīng)康復實驗研究和臨床應用

7、提供一定的基礎。 方法：從SD大鼠胎鼠SVZa(Anterior subventricularzone，室管膜前下區(qū))分離和培養(yǎng)NSCs。在加入5％胎牛血清(FBS)和不同濃度GKB的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h、12h、24h、3d和7d，用倒置相差顯微鏡測量分化細胞突起數(shù)目、突起長度和胞體面積，用免疫熒光細胞化學染色方法檢測其微管相關(guān)蛋白(β-Tubulin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細胞特異性蛋白(CC-1)的表達，

8、并計算陽性細胞的百分率。同時檢測細胞因子SOCS2、轉(zhuǎn)錄因子Id2的表達，計算SOCS2、Id2陽性細胞百分率、SOCS2、Id2免疫反應物的平均光密度值。 結(jié)果： 1.NSCs培養(yǎng)、鑒定。從SD大鼠胎鼠SVZa成功分離和培養(yǎng)NSCs，傳代后Nestin染色陽性鑒定。 2.銀杏內(nèi)酯B組分化細胞的神經(jīng)突起數(shù)目增多、長度增長、胞體面積增大。在相同時相點(24h或3d、7d)，20mg/L、40mg/L、60mg/L

9、GKB組神經(jīng)突起數(shù)目、平均長度、胞體面積與對照組比較均有顯著差異(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組神經(jīng)突起數(shù)目、突起長度、胞體面積與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/LGKB組與60mg/L GKB組比較無顯著差異(P>0.05)。在不同時相點組間比較(24h和3d)，在突起長度方面，各GKB組和對照組3d突起長度與24h突起長度比較均有顯著差異(P<0.01)；在突起數(shù)目方面，對照組

10、3d突起數(shù)目比24h突起數(shù)目有所增加，但無顯著差異(P>0.05)，而各GKB組3d突起數(shù)目比24h突起數(shù)目比較有顯著差異(P<0.01)， 3.銀杏內(nèi)酯B組β-Tubulin陽性神經(jīng)元樣細胞百分率增加，GFAP陽性星形膠質(zhì)樣細胞百分率隨GKB濃度的增加而增加，CC-1陽性少突膠質(zhì)樣細胞百分率無明顯變化。在相同時相點(3d、7d)，20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組β-Tubulin陽性神經(jīng)元樣細胞百分率較對照組

11、明顯升高(P<0.01)，40mg/L GKB組、60mg/L GKB組β-Tubulin陽性神經(jīng)元樣細胞百分率與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無顯著差異(P>0.05)；20mg/L、40mg/L、60mg/LGKB組GFAP陽性星形膠質(zhì)樣細胞百分率與對照組比較有明顯升高(P<0.01)，各GKB組組間比較均有顯著差異(P<0.05-0.01)。各GKB組CC

12、-1陽性少突膠質(zhì)樣細胞百分率與對照組比較無顯著差異(P>0.05)。 4.銀杏內(nèi)酯B組轉(zhuǎn)錄因子Id2陽性細胞百分率及免疫反應物的平均光密度值減少。在時相點7d，對照組、20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組Id2陽性細胞百分率分別為66.240/0、57.46％、51.52％、52.0％，Id2免疫反應物的平均光密度值分別為5.272、4.457、3.820、3.702。經(jīng)統(tǒng)計分析，20mg/L、40mg/L、60m

13、g/L GKB組Id2陽性細胞百分率和免疫反應物的平均光密度值較對照組顯著減少(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組Id2陽性細胞百分率和免疫反應物的平均光密度值與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無顯著差異(P>0.05)。 5.銀杏內(nèi)酯B組細胞因子SOCS2陽性細胞百分率及免疫反應物的平均光密度值增加。在時相點7d，對照組、20mg/L、

14、40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽性細胞百分率分別為22.17％、30.24％、35.46％、34.72％，SOCS2免疫反應物的平均光密度值分別為1.134、1.382、1.578、1.527。經(jīng)統(tǒng)計分析，20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽性細胞百分率和免疫反應物的平均光密度值與對照組比較有顯著差異(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽性細胞百分率和免疫反應物的平均

15、光密度值與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：GKB使分化的神經(jīng)細胞神經(jīng)突起數(shù)目增多、長度增長、胞體面積增大；GKB提高分化細胞中神經(jīng)元樣細胞百分率，星形膠質(zhì)樣細胞百分率與銀杏內(nèi)酯B呈劑量依賴關(guān)系，對少突膠質(zhì)樣細胞百分率則無明顯影響；GKB增加SOCS2陽性細胞百分率及免疫反應物的平均光密度值，減少Id2陽性細胞百分率及免疫