低濃度二甲雙胍誘導肝癌細胞衰老及分子機制研究.pdf

1、目的：
　　肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一種惡性程度高，進展快，易轉(zhuǎn)移，預后差的腫瘤。在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中，發(fā)病率排第五位，死亡率位居第二位，且近年來發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢。由于起病隱匿，早期診斷率低，對放化療不敏感，患者肝功能受損，耐受性差，導致肝癌總體治療效果并不理想。目前雖然對肝癌的防治研究取得了一定進展，但仍遠未闡明。
　　二甲雙胍是一種臨床上廣泛應用的降糖藥物，近年

2、來流行病學研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，引起科學界廣泛關注，但其機制尚未闡明。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度二甲雙胍主要誘導肝癌細胞凋亡，這與以往的研究結(jié)果相一致。令我們感興趣的是，低濃度二甲雙胍則通過激活 AMPK/SIRT1通路誘導肝癌細胞衰老，從而抑制肝癌細胞增殖。為了更好地體現(xiàn)藥物在體內(nèi)的分布及代謝對腫瘤生長的影響，本研究擬通過建立裸鼠皮下移植肝癌和原位移植肝癌模型，腹腔注射不同濃度二甲雙胍，探討藥物對裸鼠移植瘤生長和衰老的影響及

3、其分子機制。本研究有望為二甲雙胍抗肝癌提供新的理論依據(jù)，并為以后利用AMPK/SIRT1信號通路作為誘導腫瘤細胞衰老的新靶點提供重要的線索。
　　方法：
　?。?）分別建立肝癌 HepG2細胞皮下移植瘤裸鼠模型和原位移植瘤裸鼠模型，依處理方法不同分為：對照組（腹腔注射0.9％生理鹽水/kg/d）、低濃度二甲雙胍組(腹腔注射Met50mg/kg/d）和高濃度二甲雙胍組(腹腔注射Met250mg/kg/d）。腫瘤種植后第10d開

4、始給藥，藥物治療周期為30天。
　?。?）皮下移植瘤裸鼠模型：在腹腔注射藥物的當天，隨后的第5d、10d、15d、20d、25d和實驗結(jié)束當天（第30d）測量裸鼠體重以及腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積(V)和抑瘤率(IR)。第30天測量皮下移植瘤裸鼠腫瘤重量。在給藥當天以及給藥后第10d、20d和30d，分別用血糖儀和肝功能自動分析儀測定裸鼠血糖和肝功能。原位移植瘤裸鼠模型：在腹腔注射藥物的當天，隨后的第5d、10d、15d、20d、

5、25d和實驗結(jié)束當天（第30d）測量裸鼠的體重，在給藥當天以及給藥后第10d、20d和30d，使用血糖儀對裸鼠血糖進行測定。
　?。?） HE染色觀察二甲雙胍對皮下移植瘤裸鼠腫瘤、肝臟、心臟、肺、腦、胃、脾、腎和小腸形態(tài)學的影響；HE染色觀察二甲雙胍對原位移植瘤裸鼠腫瘤和肝臟形態(tài)學的影響。
　　（4）免疫組織化學方法檢測兩種裸鼠腫瘤組織標本中 Ki-67和 Cleaved caspase-3蛋白的表達；采用細胞衰老特異性β-

6、半乳糖苷酶原位染色試劑盒檢測二甲雙胍對兩種裸鼠腫瘤組織衰老的影響。
　?。?）采用免疫組化實驗檢測兩種裸鼠腫瘤組織中AMPK/SIRT1信號通路相關分子p-AMPK、SIRT1、p-SIRT1、Ac-p53和p21蛋白的表達情況；Western blot實驗檢測兩種裸鼠腫瘤組織中AMPK/SIRT1信號通路相關分子AMPK、p-AMPK、SIRT1、p-SIRT1、p53、Ac-p53和p21的表達情況。
　　結(jié)果：

7、　?。?）兩種移植瘤裸鼠模型，每種模型60只，皮下移植瘤裸鼠模型成瘤率為100%，原位移植瘤裸鼠死亡6只，成瘤率為90%。在整個實驗期間，裸鼠對藥物的耐受良好，沒有出現(xiàn)厭食等異常情況。分別測量兩種裸鼠體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間體重相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。皮下移植瘤裸鼠模型：腫瘤重量測量結(jié)果顯示，和對照組相比，Met50組腫瘤重量減輕（P<0.05），Met250組腫瘤重量明顯下降（P<0.01）。對三組裸鼠皮下移植瘤大小進行

8、測量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物治療的第20d、25d和30d，與對照組相比，Met250組裸鼠腫瘤體積變小，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過計算腫瘤抑瘤率( IR)發(fā)現(xiàn)，Met50組、Met250組腫瘤抑制率分別為25.6%和48.3%。上述結(jié)果表明二甲雙胍能夠顯著抑制皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織的生長，其中高濃度組效果更明顯。
　?。?）使用血糖儀和肝功能自動分析儀分別測定皮下移植瘤裸鼠血糖和肝功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間血糖及肝功能相比，差異無

9、統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示藥物不影響皮下移植瘤裸鼠血糖和肝功能，這與原位移植瘤裸鼠血糖檢測結(jié)果相一致。
　?。?）對皮下移植瘤裸鼠腫瘤、肝臟、心臟、肺、腦、胃、脾、腎和小腸采用HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組裸鼠腫瘤組織內(nèi)粉紅色壞死灶明顯升高，其它臟器三組間均未見異常變化；對原位移植瘤裸鼠腫瘤和肝臟采用HE染色，和對照組相比，實驗組裸鼠腫瘤組織內(nèi)粉紅色壞死灶明顯升高，肝臟組織三組間相比，均未見明顯差異。
　?。?

10、）采用免疫組化實驗檢測二甲雙胍對兩種裸鼠移植瘤組織增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，實驗組Ki-67陽性表達率顯著降低（P<0.01），而Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高（P<0.01），Met250組尤其明顯。初步提示：高濃度二甲雙胍主要通過促進裸鼠腫瘤細胞凋亡從而顯著抑制腫瘤細胞的增殖，這與已報道的研究結(jié)果相一致。分別對兩種移植瘤裸鼠三組腫瘤組織采用衰老相關β-半乳糖苷酶染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，

11、Met50組裸鼠腫瘤組織衰老染色顯著增加（ P<0.01）， Met250組腫瘤組織衰老染色也明顯增多（P<0.05），對Met50組和Met250組裸鼠腫瘤組織衰老染色比較發(fā)現(xiàn)，Met50組陽性染色明顯增多（P<0.05）。結(jié)果提示，低濃度二甲雙胍主要通過誘導裸鼠腫瘤細胞衰老而抑制腫瘤細胞增殖。
　?。?）通過免疫組化和Western blot實驗檢測兩種移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)相關蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，Met50組裸

12、鼠腫瘤組織內(nèi)p-AMPK、p-SIRT1、Ac-p53和p21蛋白表達水平明顯上調(diào)，而AMPK、SIRT1、p53蛋白的表達卻未見明顯差別。這些結(jié)果表明，低濃度二甲雙胍通過激活 AMPK，上調(diào)SIRT1的磷酸化水平，抑制其去乙?；富钚?，促進p53乙?；?，使p53下游靶基因p21表達上調(diào)，從而誘導肝癌細胞衰老。
　　結(jié)論：
　　（1）低濃度二甲雙胍主要誘導肝癌裸鼠腫瘤細胞衰老，高濃度二甲雙胍則主要誘導肝癌裸鼠腫瘤細胞凋亡。<