二甲雙胍抑制人前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及作用機制的研究.pdf

1、前列腺癌(ProstateCancer,PCa)是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來，前列腺癌在我國的發(fā)病率快速增長，正日益成為嚴(yán)重威脅老年男性健康的疾病。目前臨床治療面臨的課題之一是如何針對“侵襲性”(aggressive)前列腺癌選擇高效低毒的藥物，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。二甲雙胍(1，1-Dimethylbiguanide)是治療Ⅱ型糖尿病最常用的藥物之一。近年來，越來越多的證據(jù)提示，二甲雙胍可以延緩部分前列腺癌患者腫瘤的生長

2、速度并降低前列腺癌的罹患風(fēng)險。但二甲雙胍的抗腫瘤機制尚未完全明確。
　　腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是前列腺癌病人死亡的重要原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，二甲雙胍可抑制TGF-β信號通路促進(jìn)的EMT過程，表現(xiàn)為TGFβ介導(dǎo)的E-cadherin下調(diào)與Vimentin上調(diào)的效應(yīng)消失。這一成果為后續(xù)研究

3、提供了一定的思路和參考。由于前列腺癌和乳腺癌均為激素相關(guān)性腫瘤，我們推測二甲雙胍對前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生過程亦可能發(fā)揮重要作用，但是目前尚未有相關(guān)研究報道。
　　本研究使用不同濃度的二甲雙胍處理前列腺癌Vcap細(xì)胞，通過MTS比色法、流式細(xì)胞術(shù)分析、劃痕和侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對Vcap細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;采用RT-PCR和Westernblot測定二甲雙胍對Vcap細(xì)胞上皮指標(biāo)物（E-cadherin、β-catenin）

4、和間質(zhì)指標(biāo)物(Vimentin、N-cadherin)mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，闡明二甲雙胍調(diào)控前列腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程的分子機制;使用RT-PCR檢測二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞后miRNA的表達(dá)水平變化，初步闡明二甲雙胍對前列腺腫瘤細(xì)胞miRNA的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.采用MTS法分別測定不同濃度二甲雙胍(1、5、10、50mmol/L)處理前列腺癌Vcap細(xì)胞24、48和72h后對細(xì)胞增殖的影響。

5、　　2.流式細(xì)胞儀檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞24h后細(xì)胞周期的分布變化。
　　3.劃痕實驗和細(xì)胞侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對前列腺癌Vcap細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用。
　　4.RT-PCR和Western-blot分別檢測5mmol/L二甲雙胍處理24h、48h后對Vcap細(xì)胞上皮指標(biāo)物(E-cadherin、β-catenin)和間質(zhì)指標(biāo)物（Vimentin、N-cadherin）mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

6、，闡明二甲雙胍調(diào)控前列腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程的分子機制。
　　5.運用RT-PCR檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞24h后對miRNA的表達(dá)水平的影響。闡明二甲雙胍對Vcap細(xì)胞miRNA的調(diào)節(jié)作用。
　　6.miR30a類似物和miR30a抑制物分別作用Vcap細(xì)胞24h、48h、72h后，采用MTS法檢測對Vcap細(xì)胞增殖的影響。運用RT-PCR檢測miR30a類似物處理Vcap細(xì)胞24h后對上皮指標(biāo)物（E-

7、cadherin）和間質(zhì)指標(biāo)物(Vimentin)mRNA的影響。闡明miR30a在二甲雙胍調(diào)控Vcap細(xì)胞EMT中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1.MTS實驗結(jié)果:二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細(xì)胞的增殖，呈濃度和時間依賴性。
　　2.二甲雙胍對Vcap細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞48h后，與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(54.1％vs.77.2％)，而S期(13.8％vs

8、.6.7％)和G2/M期(32.1％vs.16.1％)細(xì)胞比例均顯著減少。
　　3.二甲雙胍抑制Vcap細(xì)胞的遷移和侵襲能力:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞48h后，劃痕愈合率顯著低于對照組，提示二甲雙胍處理后，腫瘤細(xì)胞的遷移能力顯著降低。侵襲小室實驗顯示5mmol/L二甲雙胍可明顯抑制Vcap細(xì)胞的侵襲能力。與對照組細(xì)胞相比，5mmol/L二甲雙胍抑制細(xì)胞侵襲的能力達(dá)到45％以上(P＜0.01，n=3)。
　　4.

9、二甲雙胍抑制Vcap細(xì)胞EMT的發(fā)生:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞24h后，EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物及間質(zhì)標(biāo)志物均發(fā)生較顯著的變化。與對照組比較，二甲雙胍處理組中，Vcap細(xì)胞的上皮性標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin的mRNA表達(dá)水平明顯升高，分別高于對照組6.2倍(P=0.023)、1.2倍(P=0.034);間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的mRNA水平明顯降低，分別較對照組低3.6倍(P=0

10、.002)和2.9倍(P=0.013)。5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細(xì)胞48h后，Westernblot顯示E-cadherin和β-catenin的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低。
　　5.二甲雙胍對Vcap細(xì)胞miRNA的調(diào)節(jié)作用:與對照組相比，5mmol/L二甲雙胍處理24h后，可明顯上調(diào)Vcap細(xì)胞中miR30a，miR143和miR196b的表達(dá)水平，其中，mi

11、R30a的變化效應(yīng)最顯著（呈3.5倍改變），但Vcap細(xì)胞的miR185和miR205的表達(dá)水平未有明顯變化。
　　6.miR30a對Vcap細(xì)胞增殖和EMT的影響:miR30a的類似物和抑制物分別作用Vcap細(xì)胞株24、48、72h后，與對照組相比，miR30a的類似物可明顯抑制Vcap細(xì)胞的增殖，而miR30a的抑制物可明顯促進(jìn)Vcap細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。進(jìn)一步的試驗發(fā)現(xiàn)，miR30a的類似物作用Vcap細(xì)胞24小時后

12、，上皮性標(biāo)志物E-cadherinmRNA水平明顯增高，而間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin的mRNA水平明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1.二甲雙胍明顯抑制前列腺癌Vcap細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性。
　　2.二甲雙胍阻滯前列腺癌Vcap細(xì)胞進(jìn)入S期，使其停留在G0/G1期。
　　3.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　4.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，該過程可能與二甲雙