二甲雙胍通過miR-26a下調(diào)Mcl-1誘導(dǎo)人口癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：
　　以人口腔癌KB細(xì)胞為研究對(duì)象，研究二甲雙胍對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響，并探討二甲雙胍對(duì)細(xì)胞影響的初步作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理24h后，在倒置顯微鏡下觀察KB細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的變化。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，平板克隆觀察二甲雙胍對(duì)口腔癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響；
　　2. KB細(xì)胞分組處理后，采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化情況；Annexin

2、 V-FITC/PI染色方法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞凋亡的影響；Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞內(nèi)Mcl-1，Bim，Bax及caspase-3蛋白的影響；
　　3. cDNA Mcl-1上調(diào)Mcl-1后，MTT，JC-1觀察上調(diào)Mcl-1二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響；Western blot法檢測(cè)口腔癌細(xì)胞中Mcl-1，Bim，Bax及caspase-3蛋白表達(dá)的變化；
　　4.qRT-PCR檢測(cè)二甲雙胍

3、處理KB細(xì)胞后miR-26a表達(dá)水平的變化；
　　5.轉(zhuǎn)染miR-26a后，集落克隆實(shí)驗(yàn)和PI單染實(shí)驗(yàn)分別用于檢測(cè)KB細(xì)胞過表達(dá)miR-26a后，二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)染mir-26a的KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響是否發(fā)生變化，隨后，再用蛋白印跡法檢測(cè)Mcl-1表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的二甲雙胍對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響
　　1)形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后，KB細(xì)胞可出現(xiàn)形態(tài)變圓

4、，體積縮小，部分細(xì)胞發(fā)生邊集并破裂成細(xì)胞碎片等顯著的形態(tài)學(xué)變化。隨著二甲雙胍濃度的增加貼壁細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，漂浮細(xì)胞逐漸增多；
　　2)MTT細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，二甲雙胍可降低人口腔癌KB細(xì)胞的活力。與對(duì)照組相比，二甲雙胍處理組的細(xì)胞活力明顯降低，并呈現(xiàn)藥物濃度和時(shí)間依賴的關(guān)系；
　　3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍可顯著抑制KB細(xì)胞的克隆形成能力；
　　4)Annexin V-FITC/PI染色顯示二甲雙胍能誘導(dǎo)細(xì)

5、胞發(fā)生凋亡，并呈濃度依賴性。
　　5)JC-1熒光檢測(cè)，紅綠熒光的相對(duì)比例降低，提示線粒體膜電位下降；
　　6)Western blot結(jié)果表明二甲雙胍能顯著下調(diào)口腔癌細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)，上調(diào)Bim、Bax的表達(dá)水平，并誘導(dǎo)caspase-3的活化。
　　2.過表達(dá)Mcl-1能夠降低口腔癌KB細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性
　　1)cDNA Mcl-1轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)
　　將cDNA Mcl-1和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入口

6、腔癌細(xì)胞KB中，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cDNA Mcl-1組中Mcl-1表達(dá)明顯升高；
　　2)cDNA Mcl-1轉(zhuǎn)染降低口腔癌細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性
　　MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cDNA Mcl-1后KB細(xì)胞的存活率較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯提高，提示cDNA Mcl-1降低了KB細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性；JC-1結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cDNA Mcl-1能抑制二甲雙胍引起的線粒體膜電位的下降。Western blot表明Mcl-1的

7、高表達(dá)抑制了KB細(xì)胞在二甲雙胍作用下細(xì)胞內(nèi)Bax及Bim蛋白的表達(dá)和Caspase-3的活性。
　　3.二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞miR-26a的調(diào)節(jié)及miR-26a對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響
　　1)與對(duì)照組相比，二甲雙胍可明顯上調(diào)細(xì)胞中miR-26a的表達(dá)水平；
　　2)用miR-26a的模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染KB細(xì)胞，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后，與二甲雙胍單獨(dú)處理組相比較，KB細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，而miR-26a

8、的抑制物則出現(xiàn)相反的結(jié)果。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-26a的模擬物轉(zhuǎn)染KB細(xì)胞后，Mcl-1水平明顯降低，且細(xì)胞凋亡率明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1.二甲雙胍能顯著抑制KB細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
　　2.上調(diào)Mcl-1后能降低口腔癌KB細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性；
　　3.二甲雙胍刺激口腔癌KB細(xì)胞后上調(diào)miR-26a的表達(dá)；
　　4.二甲雙胍對(duì)口腔癌增殖及凋亡的影響可能與二甲雙胍上調(diào)miR-26a表達(dá)有關(guān)