二甲雙胍(Metformin)誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞自噬的機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　背景：二甲雙胍（metformin）是一種在世界上廣泛應(yīng)用的，針對(duì)二型糖尿病的口服降糖藥。流行病學(xué)的研究證明，長(zhǎng)期服用二甲雙胍的糖尿病患者得癌癥的幾率很小，這可能是由于二甲雙胍具有抗腫瘤的作用。最近的許多體內(nèi)和體外的研究也有證明二甲雙胍有抗腫瘤的作用，但是具體的機(jī)制還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)主要是證明了二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并且對(duì)二甲雙胍抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。
　　目的：

2、
　　1.研究二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　2.研究二甲雙胍抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制
　　材料和方法:
　　用含10％超級(jí)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%，用相對(duì)應(yīng)的抑制劑或激活劑(Compound C,3-MA, chloroquine, Rapamycin等)預(yù)處理細(xì)胞1h，然后再用含不同濃度的二甲雙胍(0mM,5mM，10mM,20mM)的培養(yǎng)

3、基處理細(xì)胞48 h后，倒置相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；DAPI染細(xì)胞核分析細(xì)胞核裂；MDC染色觀察酸性自噬泡結(jié)構(gòu)；TEM觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；免疫熒光，Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量以及在細(xì)胞中的亞定位；caspase-3試劑盒檢測(cè)caspase-3酶活性的變化；Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞所占比例；羅丹明123染細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線

4、粒體膜電位的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法檢測(cè)顯示不同劑量的二甲雙胍對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有不同程度的殺傷作用，這種生長(zhǎng)抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。倒置相差顯微鏡可見(jiàn)二甲雙胍誘導(dǎo)后的細(xì)胞里有明顯的泡狀物，且貼壁的A549細(xì)胞變得很容易脫離培養(yǎng)皿的底部。通過(guò)DAPI染細(xì)胞核未見(jiàn)明顯的細(xì)胞核裂，但Caspase-3的酶活實(shí)驗(yàn)證明了Caspse-3確實(shí)被激活。且通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞，然后用流式

5、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞可見(jiàn)明顯的早期凋亡現(xiàn)象，羅丹明123染細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生明顯的下降現(xiàn)象。但透射電鏡未顯示A549細(xì)胞中有凋亡小體出現(xiàn)，細(xì)胞核的染色體也未見(jiàn)明顯趨邊、固縮。
　　2. MDC染色，LC3的免疫熒光，透射電鏡及Western Blot技術(shù)檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)0-20 mM二甲雙胍作用A549細(xì)胞48 h后，A549細(xì)胞出現(xiàn)有明顯自噬現(xiàn)象。
　　3. Western Blotting檢測(cè)自噬相

6、關(guān)通路的蛋白表達(dá)，隨著二甲雙胍作用濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，AMPK-mTOR通路被激活，激活p-AMPK,下游的p-mTOR， p-p70s6K表達(dá)量降低，這種升高或降低能明顯的被AMPK的抑制劑Compound C所逆轉(zhuǎn)，同時(shí)透射電鏡顯示自噬體的產(chǎn)生也隨著抑制劑的加入而減少，western blot檢測(cè)也顯示LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化明顯減少， Caspase-3的酶活性也隨著Compound C的加入而減弱。
　　4.當(dāng)用合適

7、濃度的自噬抑制劑3-MA和氯喹來(lái)成功抑制二甲雙胍誘導(dǎo)的自噬的時(shí)候，用MTT法檢測(cè)到的A549的細(xì)胞活力也相應(yīng)的升高，同時(shí)用Caspase-3的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到的Caspase-3的酶活性也相應(yīng)的降低，用 western blot法檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白PARP1的剪切也受到相應(yīng)的抑制。
　　5.當(dāng)用合適濃度的Caspase-3的特異抑制劑來(lái)抑制凋亡的時(shí)候， western blot檢測(cè)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化也明顯增加。
　　結(jié)

8、論:
　　1.二甲雙胍在一定濃度、時(shí)間范圍內(nèi)抑制體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，其機(jī)制與二甲雙胍誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡有關(guān)。同時(shí)二甲雙胍也會(huì)誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生一定程度的凋亡。
　　2.二甲雙胍能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬，與二甲雙胍激活A(yù)549細(xì)胞中的AMPK有關(guān)。且二甲雙胍誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生的凋亡也和AMPK的激活有關(guān)。
　　3.抑制二甲雙胍誘導(dǎo)的A549的自噬將會(huì)對(duì)減弱二甲