內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在利福平誘導的藥物性肝損傷中的作用和機制研究.pdf

1、利福平是一種一線抗結(jié)核藥物，其引起的肝細胞毒性是一個重要的臨床問題。目前對于利福平引起肝細胞損傷的具體機制還知之甚少。本文在體外條件下觀察了利福平引起L02細胞、HepG2細胞損傷及其演變過程，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激角度觀察了利福平對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白和膽汁酸轉(zhuǎn)運體相關(guān)蛋白表達、蛋白定位及基因表達的影響，運用分子生物學技術(shù)觀察了CHOP基因、Nrf2基因沉默及過表達對利福平誘導細胞損傷的影響，以及采用藥物4-苯基丁酸（4-PBA）干預的方法，初步

2、探討了利福平致肝細胞損傷的分子機制。
　　1.利福平誘導L02細胞毒性損害研究
　　為研究利福平誘導L02細胞損傷的劑量-效應和時間-效應關(guān)系，不同劑量的利福平（100μM，200μM，300μM，400μM）給藥不同時間（12 h，24 h，36 h，48 h）后，倒置顯微鏡下觀察L02細胞形態(tài)學改變，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率變化，MTT法檢測細胞存活率變化，ELISA及微板法檢測細胞培養(yǎng)上清中ALT、AST、AKP、LD

3、H和ATP水平等方法，觀察利福平的細胞毒性。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常 L02細胞呈單層貼壁生長，形態(tài)與類上皮樣細胞相似。給予利福平后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，并且隨著利福平劑量增加及給藥時間的延長，細胞形態(tài)改變愈加明顯，細胞變成長梭形甚至形態(tài)不均，貼壁細胞數(shù)量減少，漂浮細胞增多，可有細胞碎片出現(xiàn)。流式細胞儀檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)隨著利福平作用濃度增加及作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸升高，200μM、300μM、400μM利福平給藥12 h即可引起

4、細胞凋亡率增加，400μM利福平給藥48 h幾乎導致所有細胞發(fā)生凋亡。MTT結(jié)果顯示細胞存活率呈逐漸下降，與細胞凋亡率趨勢相反。當利福平劑量超過100μM細胞存活率明顯抑制，當作用時間超過24 h，四個劑量對細胞活力都有明顯的影響。利福平24 h的IC50值是548.91μM，48 h IC50大約是234.96μM。同時，200μM利福平給藥48 h細胞培養(yǎng)上清中ALT、AST、AKP、LDH和ATP水平均明顯升高。
　　2.利

5、福平激活L02細胞PERK-ATF4-CHOP通路的研究
　　為探討利福平誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡反應，100μM、200μM利福平給藥48 h，觀察其對GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達及基因表達的影響。200μM增加了GRP78、PERK和ATF4的蛋白表達，而對CHOP蛋白表達未見明顯影響。在基因水平，200μM利福平增加了GRP78、PERK、ATF4及CHOP的基因表達水平。100μM利福平?jīng)]有明顯的刺激作用。這表明

6、利福平可以在蛋白和基因水平上激活PERK-ATF4-CHOP通路，并且具有劑量依賴性。
　　接下來我們觀察了200μM利福平治療12 h、24 h及48 h對PERK-ATF4-CHOP通路的影響。結(jié)果顯示12 h、24 h蛋白水平無變化，48 h時GRP78、PERK和ATF4的蛋白表達增加。在基因水平，利福平治療12 h ATF4及CHOP表達增加，24 h時GRP78、ATF4及CHOP表達增加，而48h時整個通路被激活。這

7、表明利福平激活PERK-ATF4-CHOP通路具有時間依賴性。
　　3. CHOP基因在利福平誘導L02細胞凋亡中的作用
　　我們通過轉(zhuǎn)染CHOP-siRNA來觀察CHOP基因沉默后對利福平誘導的細胞凋亡的影響?；虺聊释ㄟ^qRT-PCR和western blot檢測。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，CHOP基因表達減少了約70%，CHOP蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化。有趣的是，CHOP基因沉默后再給予利福平治療，在蛋白水平

8、，GRP78、PERK、ATF4的表達均減少；在基因水平，CHOP、GRP78、PERK以及ATF4的表達均減少。同時發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡率下降，細胞的存活率升高，細胞培養(yǎng)上清中LDH水平也下降。
　　我們通過轉(zhuǎn)染CHOP過表達質(zhì)粒來觀察CHOP基因過表達后對利福平誘導的細胞凋亡的影響。同樣，基因表達效率通過qRT-PCR和western blot檢測。與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比，CHOP基因表達的水平增加了243倍，CHOP蛋白表達增加

9、了17倍，CHOP基因過表達后再給予利福平治療，在蛋白水平，GRP78、PERK、ATF4的表達未發(fā)生顯著改變；在基因水平，GRP78的表達明顯增加。同時發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡率增加，細胞的存活率降低，以及上清中LDH水平上升。
　　4.4-PBA抑制利福平誘導的L02細胞PERK-ATF4-CHOP通路的激活
　　經(jīng)4-PBA治療后，利福平誘導的GRP78、PERK及 ATF4蛋白表達降低，CHOP、JNK、p-JNK蛋白表達無明

10、顯改變。GRP78、PERK、ATF4及 CHOP的基因表達水平均顯著降低。免疫熒光分析表明 GRP78、PERK及 ATF4的熒光強度降低，CHOP熒光強度無明顯改變。表明4-PBA可以在蛋白水平和基因水平抑制利福平誘導的PERK-ATF4-CHOP通路的激活。
　　5.4-PBA對L02細胞的保護作用
　　利福平能導致明顯的細胞凋亡，經(jīng)4-PBA治療后細胞的凋亡率出現(xiàn)下降。MTT結(jié)果顯示經(jīng)4-PBA治療后，4-PBA+利

11、福平組細胞存活率較利福平組升高。4-PBA治療后，ALT、AST、AKP、LDH及ATP水平均下降。
　　6.利福平誘導HepG2細胞毒性損害研究
　　為研究利福平誘導HepG2細胞損傷的效應，不同劑量的利福平（100μM，200μM，300μM，400μM）給藥不同時間（24 h，48 h）后，倒置顯微鏡下觀察HepG2細胞形態(tài)學改變，MTT法檢測細胞存活率變化，ELISA及微板法檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH、ALT、AST、

12、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及ATP水平等方法，觀察利福平的細胞毒性。
　　倒置顯微鏡下，正常的HepG2細胞形態(tài)似上皮細胞樣，細胞間相互連接，密集成片生長，胞漿內(nèi)未見透明顆粒。給予利福平后，隨著利福平作用濃度增加及作用時間的延長，細胞也變成長梭形甚至形態(tài)不均，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞散在生長，漂浮細胞明顯增多，折光加強。MTT檢測發(fā)現(xiàn)隨著利福平作用濃度增加及作用時間的延長，細胞存活率逐漸下降，同時細胞培養(yǎng)

13、上清中LDH、ALT、AST、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及 ATP的水平逐漸升高，呈現(xiàn)出一定的劑量效應和時間效應。利福平24 h的IC50值是550.50μM，48 h IC50大約是311.01μM。
　　7.利福平激活HepG2細胞膽汁酸轉(zhuǎn)運體及Nrf2表達的研究
　　為探討利福平誘導膽汁酸轉(zhuǎn)運體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激適應性反應因子Nrf2的表達，不同劑量的利福平給藥不同時間后，觀察其對膽汁酸轉(zhuǎn)運體和N

14、rf2蛋白表達及基因表達的影響。在24 h，BSEP、MDR1、總Nrf2及胞核Nrf2的蛋白表達有不同程度增加。NTCP和胞漿Nrf2蛋白表達有不同程度減少。BSEP、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ、總Nrf2的基因表達有不同程度增加。
　　在48 h，BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ及總Nrf2的蛋白表達和基因表達均有不同程度增加。胞漿Nrf2蛋白表達有不同程度減少，胞核Nrf2的蛋白表達

15、有不同程度增加。
　　8. Nrf2基因在利福平誘導HepG2細胞膽汁酸轉(zhuǎn)運體表達中的作用
　　我們通過轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA及Nrf2過表達質(zhì)粒來觀察Nrf2基因?qū)Ｆ秸T導HepG2細胞膽汁酸轉(zhuǎn)運體表達的影響?；虺聊释ㄟ^qRT-PCR和western blot檢測。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，Nrf2基因表達減少了90%，總Nrf2蛋白、胞漿Nrf2蛋白表達減少了50%，胞核Nrf2蛋白表達減少了70%。Nr

16、f2基因沉默后再給予300μM利福平治療48 h，BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ的蛋白及基因表達都有不同程度減少。細胞的存活率下降，細胞培養(yǎng)上清LDH水平上升。
　　轉(zhuǎn)染了過表達質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比，Nrf2基因表達增加了50倍，總Nrf2蛋白、胞漿Nrf2蛋白表達增加了2倍，胞核Nrf2蛋白表達增加了5倍。Nrf2基因過表達后再給予利福平治療，膽汁酸轉(zhuǎn)運體的表達均增加。同時細胞的存活率上升，細

17、胞培養(yǎng)上清LDH水平下降。
　　根據(jù)以上研究結(jié)果，本文得出以下結(jié)論：（1）利福平能夠激活PERK-ATF4-CHOP通路，這與其誘導的細胞損傷密切相關(guān)，并且CHOP是利福平誘導細胞凋亡的作用靶點之一；（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA能夠抑制利福平誘導的PERK-ATF4-CHOP通路蛋白表達和基因表達，抑制L02細胞凋亡，增加細胞存活率，降低細胞損傷標志物的水平，因此具有細胞保護作用；（3）Nrf2介導了利福平誘導的膽汁酸轉(zhuǎn)運體適