依維莫司對實驗性自身免疫性神經炎治療作用的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　吉蘭巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)是一種影響周圍神經系統(peripheral nervous system，PNS)的自身免疫性疾病和急性炎癥性疾病，是目前世界范圍內最常見的急性弛緩性癱瘓原因之一,是嚴重的神經系統突發(fā)事件的主要來源【1】。實驗性自身免疫性神經炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)已經作為GBS的經典動物模型被

2、廣泛接受。巨噬細胞在炎性環(huán)境中有兩種模式，即具有促炎作用的M1模式,和具有抗炎作用的M2模式，他們之間可以互相轉化【2-3】。依維莫司(RAD001)屬于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑，作為強有力的免疫調節(jié)劑，已被用于治療癌癥和自身免疫性疾病【4-10】并且發(fā)揮了積極的作用。
　　截至目前，許多抗炎、免疫調節(jié)劑及單克隆抗體均作為治療GBS的可能選擇而在EAN上試用，但有關RAD001對于GBS的調節(jié)及治療作用尚無報道?；?/p>

3、于以往關于RAD001免疫調節(jié)作用的研究，我們假設RAD001對于EAN具有抗炎和神經保護作用，分別在EAN大鼠的免疫階段和發(fā)病階段應用RAD001進行藥物干預，通過觀察EAN大鼠的臨床評分、病理變化、電生理指標、M1/M2巨噬細胞表型的分布和炎性環(huán)境變化，來分析mTOR通路的抑制和Akt的激活對EAN的作用，進而評價RAD001對EAN大鼠的治療作用，并探討其作用機制。
　　研究方法：
　　乳化P0180-199肽段后，誘

4、導Lewis大鼠成模。將造模后的大鼠隨機分組，分為對照組，RAD001預防用藥組和治療用藥組。采用雙盲法觀察并評估大鼠每天的臨床癥狀。在疾病高峰期，即免疫后第16天，進行坐骨神經肌電圖檢測評估坐骨神經電生理受損情況，指標包括誘發(fā)復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅、潛伏期和運動神經傳導速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。在疾病高峰

5、期，對大鼠坐骨神經進行取材，準備進行組織病理學檢測評估炎癥細胞浸潤和脫髓鞘情況，并進行免疫熒光檢測分析巨噬細胞分化情況；同時提取坐骨神經總蛋白，進行蛋白印跡分析，探討mTOR通路蛋白變化情況。在疾病高峰期，對大鼠脾臟取材，提取單個核細胞，分析淋巴細胞增殖情況，采用聚合酶鏈式反應和酶聯免疫吸附試驗檢測炎性細胞因子表達情況及應用流式細胞術檢測巨噬細胞分化情況。應用GraphPad Prism5.0軟件對資料進行統計分析，p<0.05為差異有

6、統計學意義。
　　研究結果：
　　1.與對照組相比，兩個RAD001治療組均可改善EAN大鼠高峰期的臨床癥狀，預防組可延遲EAN大鼠的發(fā)病時間。RAD001治療可以減輕EAN引起的周圍神經損傷。與對照組相比，RAD001預防組和治療組炎性細胞數量減少,髓鞘脫失程度減輕（p<0.05）。神經電生理檢測表明，控制組MNCV明顯減慢，兩個治療組CMAP明顯升高，潛伏期顯著縮短。
　　2. Western印跡分析RAD001對

7、于EAN大鼠坐骨神經中p-P70S6K、p-4E-BP1和p-Akt的作用，發(fā)現與對照組相比，RAD001預防組和治療組中EAN大鼠坐骨神經切片中p-Akt表達增加，p-4E-BP1和p-P70S6K表達減少(p<0.05)。
　　3. P0180-199刺激后，相對于對照組的OD值（2.35±0.34），在預防組（0.98±0.16）,和治療組（0.73±0.18）的淋巴細胞增殖均可被抑制，差異具有統計學意義(p<0.05)。對

8、于沒有P0180-199的刺激，三個組之間也有統計學差異(p<0.05)。說明RAD001抑制淋巴細胞增殖反應。
　　4.坐骨神經免疫熒光結果表明，與對照組相比，RAD001預防組和治療組均顯示M2巨噬細胞表型表達升高，M1巨噬細胞表型表達降低(p<0.05)。脾單個核細胞流式細胞術分析表明，RAD001預防組和治療組M2巨噬細胞水平較對照組有明顯升高（p<0.05）。說明RAD001促進M2巨噬細胞極化。
　　5. RAD

9、001對細胞因子的影響:與對照組相比，一些促炎癥因子（IL-1α、IFN-γ、RANTES和IL-17）在蛋白和/或mRNA水平上在RAD001預防組和治療組表達量明顯降低,而抗炎細胞因子（IL-10、TGF-β和IL-4）在蛋白和/或mRNA水平上含量顯著增加(p<0.05)。但三組中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL–12、IL-13、TNF-α或GM-CSF沒有顯著區(qū)別。
　　研究結論：
　　我們的研究表明