L161982對大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎中巨噬細(xì)胞亞型變化的影響.pdf

1、研究目的:
　　吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是以周圍神經(jīng)組織脫髓鞘病變及炎性細(xì)胞浸潤為病理特點(diǎn)的自身免疫性周圍神經(jīng)性疾病，臨床表現(xiàn)為急性對稱性弛緩性肢體癱瘓。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental allergicneuritis，EAN)是T細(xì)胞介導(dǎo)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病，因其與GBS具有相似的臨床及病理特點(diǎn)而成為研究人類GBS的經(jīng)典動物模型。
　　在EAN的

2、發(fā)病過程中，巨噬細(xì)胞作為一種經(jīng)典的免疫細(xì)胞，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明，巨噬細(xì)胞在EAN病理過程中主要表現(xiàn)為兩種亞型:經(jīng)典活化的M1亞型巨噬細(xì)胞及選擇性活化的M2亞型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥進(jìn)展及較強(qiáng)的吞噬作用，而M2型巨噬細(xì)胞具有抑制炎癥，促進(jìn)組織重塑和修復(fù)作用。巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍未十分明確。
　　前列腺素(PG)作為疾病炎癥過程中的非細(xì)胞介質(zhì)參與EAN炎癥的發(fā)生發(fā)展。尤其以前列腺素E2與

3、前列腺素EP2及EP4受體相互作用的促炎性作用更為突出。已有研究證實(shí)，使用PGE2-EP4受體拮抗劑L161982可以促進(jìn)包括EAE在內(nèi)的自身免疫疾病的炎癥恢復(fù)，減輕臨床癥狀。
　　本研究通過建立EAN大鼠模型，使用前列腺素E2-EP4受體拮抗劑L161982對EAN不同發(fā)病階段進(jìn)行干預(yù)，觀察巨噬細(xì)胞M1及M2亞型在EAN不同發(fā)病階段的比例變化及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化，探討PGE2-EP4信號通路對M1與M2亞型轉(zhuǎn)化的影響，進(jìn)一

4、步探索促進(jìn)EAN自發(fā)性恢復(fù)的機(jī)制。
　　2.研究方法:
　　1.抗原制備采用高速離心法自新鮮的牛神經(jīng)根提取周圍神經(jīng)髓磷脂(bovine peripheralnerve myelin，BPM)。將提取的BPM溶于含H37Ra熱滅活結(jié)核菌的不完全弗氏佐劑中，邊震蕩混勻邊加入等量生理鹽水制成混懸液。其中，每100ul抗原乳劑含BPM5mg，結(jié)核桿菌1mg。
　　2.實(shí)驗(yàn)動物處理
　　2.1 建立EAN模型21只健康、清

5、潔的6-8周(160-170g)齡雌性Lewis大鼠于SPF級實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。10％水合氯醛(0.3g/kg)麻醉大鼠，于大鼠雙后足墊皮下注射制備好的抗原乳劑（每只200ul），制備EAN動物模型。
　　2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及藥物干預(yù)將21只EAN大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，其中將A組設(shè)為空白對照組。A組大鼠每日腹腔注射L161982溶媒(5mg/kg)，B組大鼠自免疫前1天～免疫第8天（免疫階段）每日腹腔注射L16198

6、2(5mg/kg)、C組大鼠自免疫第5～16天（發(fā)病期）每日腹腔注射L161982(5mg/kg)。
　　3.臨床評分自免疫前1天開始每日對3組大鼠進(jìn)行體重稱量和臨床評分，直至免疫第16天。臨床評分標(biāo)準(zhǔn)如下:①0分:正常;②0.5分:全尾肌張力下降;③1.0分:尾部肌肉癱，松軟拖地;④1.5分:輕度后肢無力或肌張力降低;⑤2.0分:重度后肢無力或輕度后肢癱;⑥2.5分:中度后肢癱;⑦3.0分:嚴(yán)重后肢癱;⑧4.0分:嚴(yán)重四肢癱。<

7、br>　　4.大鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取于免疫第16天（發(fā)病高峰期）處死3組大鼠，于無菌實(shí)驗(yàn)臺上，向大鼠腹腔注射10mlDMEM，靜置5min后，打開大鼠腹腔，待腸管變扁時(shí)，用2ml無菌一次性吸管吸取腹腔灌洗液，置于離心管中。于離心機(jī)上離心后，去上清，留沉淀，制備單細(xì)胞懸液。對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照將細(xì)胞按2×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后換液，去掉未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至第3天。
　　5.

8、流式細(xì)胞術(shù)檢測EAN大鼠腹腔巨噬細(xì)胞亞型比例3組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)3天后，取6支流式管(編號為1、2、3、4、5、6)，試管1～5每管中加入106個(gè)/mL巨噬細(xì)胞。試管6為空白對照。用PE標(biāo)記的CD86抗體、Alexa Flour647標(biāo)記的CD163抗體及抗兔CD68抗體及FITC標(biāo)記熒光二抗等不同熒光抗體組合分別標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞及總巨噬細(xì)胞。試管1加入PE標(biāo)記的CD86抗體，試管2加入Alexa Flour647

9、標(biāo)記的CD163抗體，試管3加入抗兔CD68抗體及FITC標(biāo)記熒光二抗，試管4加入PE標(biāo)記的CD86抗體、抗兔CD68抗體及FITC標(biāo)記熒光二抗，試管5加入Alexa Flour647標(biāo)記的CD163抗體、抗兔CD68抗體及FITC標(biāo)記熒光二抗。試管6為空白對照。充分混勻后，置于室溫暗處孵育30min后，各管加入2mLBSA進(jìn)行洗滌，1500r/min離心5min后，棄上清。每管加入400μ LPBS重懸，經(jīng)細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，加入1％的多

10、聚甲醛100μ L固定，待上機(jī)檢測。用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組大鼠兩種巨噬細(xì)胞亞群比例。
　　6.ELISA檢測EAN大鼠脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子3組EAN大鼠脫頸處死后，無菌條件下摘取EAN大鼠脾臟，置于含5mlDMEM培養(yǎng)基的離心管中，將脾臟置于無菌實(shí)驗(yàn)臺上剪碎后于細(xì)胞篩上研磨脾臟碎片，收集脾單個(gè)核細(xì)胞研磨液。置于離心管中，1200 rpm/min，離心5 min后棄上清并混勻。每管加入2ml紅細(xì)胞裂解液，于室溫下靜置5min后

11、，待細(xì)胞懸液變?yōu)闊o色后，每管加入1ml胎牛血清終止破紅。1200 rpm/min，離心5 min后棄上清，加入2mlDMEM培養(yǎng)基并混勻。充分混勻后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞按2×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3天后，收集六孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清，置于2ml離心管中，3組大鼠單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3天后，取各組大鼠脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測3組大鼠脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12及

12、IL-10的含量。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，應(yīng)用單因素方差分析(one—factor analysis ofvariance，ANOVA)比較3組間差異，兩兩比較采用LSD法，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviatio，SD)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.各組大鼠的發(fā)病情況和臨床評分自免疫后第6天至第15天，各組大鼠均發(fā)生EAN癥狀。與A組比較，B組、C組發(fā)

13、病時(shí)間均明顯延遲(P＜0.05)，B組大鼠發(fā)病時(shí)間較C組明顯延遲(P＜0.05);與A組比較，B組、C組發(fā)病高峰期臨床評分明顯降低(P＜0.05);與C組比較，B組大鼠臨床評分降低明顯(P＜0.05)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測3組大鼠巨噬細(xì)胞亞群比例A組相比，使用L161982治療的B組、C組中，CD86+細(xì)胞占腹腔灌洗細(xì)胞的百分比明顯降低(P＜0.05)，CD86+細(xì)胞占CD68+細(xì)胞的百分比明顯降低，CD163+細(xì)胞占CD68

14、+細(xì)胞的百分比明顯升高(P＜0.05);與C組比較，B組中CD86+細(xì)胞占腹腔灌洗細(xì)胞的百分比降低更明顯(P＜0.05)，CD86+細(xì)胞占CD68+細(xì)胞的百分比降低更明顯(P＜0.05)，CD163+細(xì)胞占CD68+細(xì)胞的百分比升高更明顯(P＜0.05)。
　　3.ELISA法檢測3組大鼠脾單核細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12、IL-10的含量與A組相比，使用L161982治療的B組、C組中，脾單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12表達(dá)量明顯降低(P

15、＜0.05)，與C組相比，B組中IL-12的含量降低更明顯(P＜0.05);與A組相比，B組、C組中IL-10的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，與C組相比，B組中IL-10的表達(dá)量升高更明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.L161982降低了EAN大鼠中M1型巨噬細(xì)胞占總巨噬細(xì)胞的比例，升高了M2型巨噬細(xì)胞占總巨噬細(xì)胞的比例，免疫階段作用更明顯。
　　2.L161982抑制了M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-12