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1、目的:本實(shí)驗(yàn)旨在建立成功的EAE模型,并在此基礎(chǔ)上探討不同劑量的阿托伐他汀對(duì)EAE的治療作用及其可能的機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和實(shí)用價(jià)值。 方法: 1、動(dòng)物分組:將100只6~8周齡雌性Wistar大鼠,體重180~200g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只,EAE模型組、小劑量治療組(2mg/kg)、大劑量治療組(8mg/kg)各30只。每組又隨機(jī)分為14天、21天、28天三個(gè)小組,每小組10只大鼠。 2、模
2、型制備:將新鮮豚鼠脊髓制成勻漿,加上完全福氏佐劑(complete Freund Adjuvant,CFA),佐劑中所含卡介苗的劑量為6mg/ml,一并混合乳化后按0.5mg/只分別于大鼠四足掌膠質(zhì)墊和背部皮下注射。治療組于模型制備第一天起給予不同劑量的阿托伐他汀灌胃治療,藥物每天一次持續(xù)給至動(dòng)物處死時(shí)為止。 3、神經(jīng)功能評(píng)分:于免疫誘導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對(duì)動(dòng)物的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察,并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,采用
3、Hooper的7分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:正常,1分:被毛不光整,尾部無力,2分:尾部癱瘓,3分:尾部癱瘓+后肢無力,4分:尾部癱瘓+后肢部分癱瘓,5分:后肢完全癱瘓,6分:四肢癱瘓,7分:瀕死狀態(tài)或死亡。 4、組織病理學(xué):在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下,快速取其脊髓中腰膨大處組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,組織切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 5、免疫組織化學(xué)染色:取動(dòng)物脊髓腰膨大處組織,石蠟包埋,做4 μm橫斷切片,經(jīng)
4、枸櫞酸鈉抗原修復(fù),山羊血清封閉,加入MMP-9多克隆抗體,再經(jīng)過二抗、三抗孵育后,DAB顯色,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察MMP-9表達(dá)情況。 6、血清中IL-4含量測(cè)定:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于14天,21天,28天時(shí)經(jīng)眼動(dòng)脈取血,留取標(biāo)本,室溫靜置1小時(shí),離心留取血清,應(yīng)用放射免疫方法對(duì)血清中IL-4含量進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果: 1、動(dòng)物發(fā)病率觀察:EAE模型組、小劑量治療組、大劑量治療組的發(fā)病率
5、分別為76.67%、53.33%、33.33%。經(jīng)R<'*>C的卡方檢驗(yàn),EAE模型組的發(fā)病率明顯高于藥物治療組(P=0.008)。而兩治療組之間的發(fā)病率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。 2、復(fù)發(fā)情況觀察:對(duì)于28天組動(dòng)物進(jìn)行疾病復(fù)發(fā)情況的觀察,每小組10只動(dòng)物中EAE模型組有7只復(fù)發(fā),小劑量組4只復(fù)發(fā),大劑量組2只復(fù)發(fā),統(tǒng)計(jì)分析顯示大劑量治療組的復(fù)發(fā)率明顯低于EAE模型組(P=0.02),小劑量治療組復(fù)發(fā)率較EAE模型組雖
6、有下降趨勢(shì),但其間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.10)。 3、行為學(xué)觀察 3.1每只大鼠發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較:EAE模型組各大鼠發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分普遍高于大劑量治療組(P=0.03),而與小劑量治療組評(píng)分之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.13)。 3.2各組大鼠總和神經(jīng)功能評(píng)分比較:EAE模型組各大鼠總和神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于大劑量治療組(P=0.01),而與小劑量治療組評(píng)分之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0
7、.11)。 4、組織病理學(xué)觀察:在疾病初期,動(dòng)物脊髓內(nèi)即出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且炎性細(xì)胞數(shù)目的多少與疾病嚴(yán)重程度相一致。三組比較,EAE模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)形成的血管袖套數(shù)目明顯高于大劑量治療組(P=0.01),而與小劑量治療組之間袖套數(shù)目的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08) 。 5、脊髓組織中MMP-9表達(dá)比較:在疾病的不同時(shí)期MMP-9在組織中的表達(dá)含量無明顯不同。三組比較,EAE模型組平均MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于大劑
8、量治療組(P=0.001),而與小劑量治療組比較其間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.07)。 6、血清中IL-4含量比較:動(dòng)物血清中IL-4在恢復(fù)期時(shí)含量最高,發(fā)病高峰期時(shí)含量最低。三組比較顯示,EAE模型組IL-4含量明顯低于大劑量治療組(P=0.04),而與小劑量治療組比較IL-4含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.36)。 結(jié)論: 1、阿托伐他汀可以降低EAE大鼠的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率,減少疾病對(duì)機(jī)體的神經(jīng)功能損害。
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