阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)旨在建立成功的EAE模型，并在此基礎(chǔ)上探討不同劑量的阿托伐他汀對(duì)EAE的治療作用及其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和實(shí)用價(jià)值。 方法： 1、動(dòng)物分組：將100只6～8周齡雌性Wistar大鼠，體重180～200g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，EAE模型組、小劑量治療組(2mg/kg)、大劑量治療組(8mg/kg)各30只。每組又隨機(jī)分為14天、21天、28天三個(gè)小組，每小組10只大鼠。 2、模

2、型制備：將新鮮豚鼠脊髓制成勻漿，加上完全福氏佐劑(complete Freund Adjuvant，CFA)，佐劑中所含卡介苗的劑量為6mg/ml，一并混合乳化后按0.5mg/只分別于大鼠四足掌膠質(zhì)墊和背部皮下注射。治療組于模型制備第一天起給予不同劑量的阿托伐他汀灌胃治療，藥物每天一次持續(xù)給至動(dòng)物處死時(shí)為止。 3、神經(jīng)功能評(píng)分：于免疫誘導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對(duì)動(dòng)物的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察，并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，采用

3、Hooper的7分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常，1分：被毛不光整，尾部無力，2分：尾部癱瘓，3分：尾部癱瘓+后肢無力，4分：尾部癱瘓+后肢部分癱瘓，5分：后肢完全癱瘓，6分：四肢癱瘓，7分：瀕死狀態(tài)或死亡。 4、組織病理學(xué)：在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，快速取其脊髓中腰膨大處組織，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 5、免疫組織化學(xué)染色：取動(dòng)物脊髓腰膨大處組織，石蠟包埋，做4 μm橫斷切片，經(jīng)

4、枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，山羊血清封閉，加入MMP-9多克隆抗體，再經(jīng)過二抗、三抗孵育后，DAB顯色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察MMP-9表達(dá)情況。 6、血清中IL-4含量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于14天，21天，28天時(shí)經(jīng)眼動(dòng)脈取血，留取標(biāo)本，室溫靜置1小時(shí)，離心留取血清，應(yīng)用放射免疫方法對(duì)血清中IL-4含量進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果： 1、動(dòng)物發(fā)病率觀察：EAE模型組、小劑量治療組、大劑量治療組的發(fā)病率

5、分別為76.67％、53.33％、33.33％。經(jīng)R<'*>C的卡方檢驗(yàn)，EAE模型組的發(fā)病率明顯高于藥物治療組(P=0.008)。而兩治療組之間的發(fā)病率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。 2、復(fù)發(fā)情況觀察：對(duì)于28天組動(dòng)物進(jìn)行疾病復(fù)發(fā)情況的觀察，每小組10只動(dòng)物中EAE模型組有7只復(fù)發(fā)，小劑量組4只復(fù)發(fā)，大劑量組2只復(fù)發(fā)，統(tǒng)計(jì)分析顯示大劑量治療組的復(fù)發(fā)率明顯低于EAE模型組(P=0.02)，小劑量治療組復(fù)發(fā)率較EAE模型組雖

6、有下降趨勢(shì)，但其間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.10)。 3、行為學(xué)觀察 3.1每只大鼠發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較：EAE模型組各大鼠發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分普遍高于大劑量治療組(P=0.03)，而與小劑量治療組評(píng)分之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.13)。 3.2各組大鼠總和神經(jīng)功能評(píng)分比較：EAE模型組各大鼠總和神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于大劑量治療組(P=0.01)，而與小劑量治療組評(píng)分之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0

7、.11)。 4、組織病理學(xué)觀察：在疾病初期，動(dòng)物脊髓內(nèi)即出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且炎性細(xì)胞數(shù)目的多少與疾病嚴(yán)重程度相一致。三組比較，EAE模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)形成的血管袖套數(shù)目明顯高于大劑量治療組(P=0.01)，而與小劑量治療組之間袖套數(shù)目的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08) 。 5、脊髓組織中MMP-9表達(dá)比較：在疾病的不同時(shí)期MMP-9在組織中的表達(dá)含量無明顯不同。三組比較，EAE模型組平均MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于大劑

8、量治療組(P=0.001)，而與小劑量治療組比較其間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.07)。 6、血清中IL-4含量比較：動(dòng)物血清中IL-4在恢復(fù)期時(shí)含量最高，發(fā)病高峰期時(shí)含量最低。三組比較顯示，EAE模型組IL-4含量明顯低于大劑量治療組(P=0.04)，而與小劑量治療組比較IL-4含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.36)。 結(jié)論： 1、阿托伐他汀可以降低EAE大鼠的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，減少疾病對(duì)機(jī)體的神經(jīng)功能損害。