雷帕霉素靶向納米藥物的制備及其作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　將前期篩選得到的，具有自我知識產(chǎn)權(quán)的泡沫細(xì)胞特異性寡核苷酸適配子（APT）與雷帕霉素納米粒構(gòu)建成為一種靶向動脈粥樣硬化病變的抗炎藥物，為開發(fā)新型動脈粥樣硬化防治新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH)為載體，采用改良的超聲-乳化-溶劑揮發(fā)法制備雷帕霉素納米粒；用粒徑大小作為指標(biāo)，選出合適的有機(jī)相；用單因素考察法，確定對納米粒和載藥量影響較大的因素；用正交試驗(yàn)法優(yōu)化出

2、最佳工藝條件并進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證；采用酸胺縮合反應(yīng)將納米粒與NH2修飾的適配子偶聯(lián)成雷帕霉素納米藥物，用瓊脂糖凝膠電泳和紅外光圖譜的特征峰考查納米粒與靶向性寡核苷酸適配子的偶聯(lián)情況；利用馬爾文激光粒度分析儀測定納米粒的粒徑和電位，透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)，在磷酸鹽緩沖液的體系中考查雷帕霉素靶向納米藥物的體外緩釋效果；用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞，油紅O染色和高效液相色譜（HPLC）法檢測泡沫細(xì)胞是否建模成功；建

3、立一個可用于檢測細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素含量的HPLC方法，并對此方法的專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和回收率進(jìn)行考察；以THP-1細(xì)胞為對照組，泡沫細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)處理組，超聲破碎法收集樣品后，用HPLC法檢測細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素含量，初步判斷雷帕霉素靶向納米藥物對泡沫細(xì)胞的靶向性。
　　結(jié)果：
　　1.雷帕霉素納米藥物的制備
　　1.1雷帕霉素HPLC檢測條件的確定：色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm,5

4、μm）；流動相：乙腈和水（90：10）；檢測波長：278 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：1 mL/min。
　　1.2雷帕霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線： A=510.37C+2.38(其中A為峰面積，C為濃度（μg/mL)，R2=1，雷帕霉素在0.1μg/mL-10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
　　1.3雷帕霉素納米粒最優(yōu)的處方工藝為：雷帕霉素為5 mg，PLGA用量為50 mg，溶于的5 mL的乙醇和丙酮的混合液中（1:

5、4），在600 rpm磁力攪拌的條件下，以1.2 min/mL的速度注入50 mL的泊洛沙姆（1％）溶液中，攪拌5 min后，冰浴超聲6 min，揮去有機(jī)溶劑，冷凍干燥后，備用。
　　1.4經(jīng)HPLC檢測，雷帕霉素納米粒的平均包封率為87%，載藥量為13%。
　　1.5通過瓊脂糖凝膠電泳和紅外光譜儀對偶聯(lián)的檢測，證明靶向適配子已經(jīng)偶聯(lián)到納米粒表面。
　　1.6靶向適配子偶聯(lián)納米粒之后發(fā)生輕微的改變，粒徑從115.0±2

6、6 nm變大到156.0±24.8 nm，電位-13.14±1.9 mV變?yōu)?22.93±3.1 mV(n=3)。
　　1.7凍干工藝為：揮去乙醇和丙酮后，加入體積比20%（V/V）4%海藻糖，按凍干曲線凍干。
　　1.8藥物緩釋試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：雷帕霉素靶向納米藥物表現(xiàn)出良好的緩釋效能，前5天的釋放量累積達(dá)到50%左右，在后續(xù)的時(shí)間，釋放量慢慢減少，兩個星期可釋放總量的70%。
　　2雷帕霉素納米藥物對泡沫細(xì)胞的靶向作用

7、r>　　2.1通過油紅O染色，泡沫細(xì)胞的胞漿體積明顯大且細(xì)胞內(nèi)含大量紅色脂滴；細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯從10.3±4.1μg/mg增到180.3±5.8μg/mg，與泡沫細(xì)胞特征相符。
　　2.2細(xì)胞內(nèi)液中雷帕霉素的出峰時(shí)間約為5.8 min，內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾RAPA測定，研究采用HPLC法檢測細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素有很好的專屬性。
　　2.3雷帕霉素靶向制劑在泡沫細(xì)胞中的含量為43 ng/106個細(xì)胞，比雷帕霉素在泡沫細(xì)胞中的含量高3.5

8、倍，P<0.05，說明雷帕霉素靶向制劑比純雷帕霉素對泡沫細(xì)胞有更好的生物相容性和靶向性；三組不同濃度的雷帕霉素靶向制劑在泡沫細(xì)胞中含量較在THP-1細(xì)胞中含量都升高，且P<0.05，進(jìn)一步說明了靶向適配子對泡沫細(xì)胞的靶向作用。
　　結(jié)論：
　　1.按正交試驗(yàn)法優(yōu)化處方工藝成功制備雷帕霉素靶向納米制劑，并得到外觀和性能良好的凍干粉針劑。
　　2.研究建立起HPLC法檢測細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素含量的方法，初步確定雷帕霉素納米靶向制