鳥氨酸脫羧酶(ODC)抑制劑的作用機制探究.pdf

1、目的：鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase，ODC)是細胞內(nèi)多胺合成的限速酶，對控制細胞內(nèi)多胺含量具有重要作用，由此成為當前抗腫瘤藥物設計新的分子靶點。ODC在細胞內(nèi)的表達水平的改變，會影響多種生長因子功能，刺激致癌基因的表達，并且會影響多胺水平，因此細胞內(nèi)ODC的表達在轉(zhuǎn)錄、翻譯和譯后各階段均受到嚴格調(diào)控。二氟甲基鳥氨酸（DFMO）是ODC不可逆抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)與鳥氨酸類似，能夠競爭性地與該酶的活性中心結(jié)合而

2、抑制ODC的活性，使多胺的合成減少。在II期臨床試驗中，DFMO由于使用劑量高并且毒副作用大而限制了它在抗腫瘤治療中的應用。因此,篩選更高效且毒副作用小的新型ODC抑制劑有重要的臨床意義。在前期的實驗中，綜合應用計算機模擬高通量篩選和分子、細胞水平上的驗證實驗，獲得了一系列可以和ODC結(jié)合，并且明顯抑制其活性的小分子，現(xiàn)階段我們對小分子抑制ODC酶活的機制進行探索。
　　方法：(1)在NCBI基因庫中尋找熒光蛋白YPET、熒光蛋白

3、CyPET、鼠源鳥氨酸脫羧酶ODC及其抗酶（AZ）序列，并將所得質(zhì)粒的基因測序后與之進行序列比對。(2)利用所得原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并表達目的蛋白，并利用親和層析，分子篩等獲得較高純度的目的蛋白。(3)建立以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)為基礎(chǔ)AZ和ODC的反應體系。(4)使用FRET體系檢測小分子對AZ和ODC單體與二聚體之間親和反應的影響。
　　結(jié)果：(1)成功表達帶有熒光標記蛋白CyPET-mAz和YPE

4、T-mODC。(2)以FRET為基礎(chǔ)，建立CyPET-mAz和YPET-mODC的反應體系。(3)使用前期檢測對ODC活性有明顯影響的小分子，使用建立的FRET檢測體系檢測出四種小分子對ODC和AZ的親和反應有影響。(4)發(fā)現(xiàn)低濃度的D4, D6, D24和D81號小分子可以抑制ODC和AZ的親和反應，并且對藥物有濃度依賴性。
　　結(jié)論：通過計算機模擬、高通量篩選和分子生物學實驗驗證并篩選出一系列能有效抑制 ODC活性的小分子化合