腺病毒介導(dǎo)的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶雙義RNA抑制肺癌A-549細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究目的] 多胺包括精胺、精瞇和腐胺，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要物質(zhì)，它可以通過(guò)改變DNA結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在多胺的生物合成過(guò)程中有兩個(gè)限速酶：鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的第一個(gè)限速酶，可催化L-鳥(niǎo)氨酸脫羧生成腐胺；S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase，S

2、AMDC)是多胺合成的第二個(gè)限速酶，催化S-腺苷蛋氨酸成S-腺苷甲硫基丙胺。國(guó)外及國(guó)內(nèi)研究證明在肺腫瘤細(xì)胞中多胺的含量明顯增高，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶及S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的含量也明顯增高，并與肺腫瘤的復(fù)發(fā)有一定的關(guān)系。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多胺的過(guò)度生成與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。如果能有效減弱多胺在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)，則可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因而研究抑制多胺合成的關(guān)鍵酶的方法就成了進(jìn)來(lái)肺癌治療的熱點(diǎn)。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylas

3、e，ODC)是多胺合成的第一個(gè)限速酶，已有研究表明，無(wú)論是以O(shè)DC競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)抑制ODC活性還是以O(shè)DC為靶標(biāo)采用反義核酸技術(shù)來(lái)抑制ODC在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，都可減少多胺在細(xì)胞的含量，從而達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。但鳥(niǎo)氨酸脫酶(ODC)并非多胺合成中的唯一限速酶。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)是多胺合成的關(guān)鍵酶。在腫瘤細(xì)胞中S-腺苷甲

4、硫氨酸脫羧酶基因表達(dá)含量亦明顯增高。有研究顯示單純抑制ODC的表達(dá)只能有效的腐胺水平，SAMDC的活性卻呈反饋性升高，精胺的濃度也相應(yīng)升高，因而不能很好的抑制多胺的生成。因此認(rèn)為，如果同時(shí)抑制ODC和SAMDC在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)才能有效降低腫瘤細(xì)胞中多胺含量，從而對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到關(guān)鍵作用。另一方面，雖然利用ODC的抑制物二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)還是SAMDC的抑制物MGBC和SAM486A等，均能競(jìng)爭(zhēng)性抑制ODC與SAMDC的

5、生物活性，但其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，非特異性的毒副作用大，不適合臨床應(yīng)用治療。因此，研究利用基因技術(shù)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞中ODC與SAMDC的表達(dá)生成及活性迫在眉睫。我們選擇肺癌為目標(biāo)，利用腺病毒同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)ODC基因與AdoMetDC基因的雙反義RNA對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步研究肺癌基因治療的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對(duì)策。 【研究方法】 ①構(gòu)建鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)雙反義RNA腺病毒載體

6、。 ②體外基因轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。采用FACS檢測(cè)Ad-GFP感染細(xì)胞中GFP表達(dá)，以測(cè)定不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的腺病毒對(duì)肺癌A-549細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。將肺癌.A-549細(xì)胞，按3×105個(gè)細(xì)胞/孔鋪于六孔板中。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液加入500μlAd-GFP病毒孵育液，感染復(fù)數(shù)分別100、50、20、10、5和0。吸出病毒孵育液，加入完全培養(yǎng)基2ml，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)。 ③

7、應(yīng)用MTF法實(shí)驗(yàn)觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)肺癌A-549細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。測(cè)定被不同感染復(fù)數(shù)重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染細(xì)胞的增殖程度，并繪制不同感染細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 ④采用Western印跡檢測(cè)肺癌A-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后，其ODC和AdoMetDC蛋白表達(dá)的量。將肺癌A-549細(xì)胞分別感染50 MOI的Ad.GFP,Ad.ODCas租Ad-0DC-A

8、doMetDCas 72 h后收集細(xì)胞。用裂解液抽提細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品濃度采用BCA法測(cè)定。 ⑤采用HPLC法檢測(cè)肺癌A-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后，其多胺的含量。收集107個(gè)細(xì)胞，用PBS沖洗兩遍后離心。將高氯酸加入到細(xì)胞沉淀中離心，取上清液。用HPIC系統(tǒng)測(cè)定多胺的含量。 ⑥應(yīng)用TUNEL標(biāo)記檢測(cè)法觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響。腺病毒Ad-ODC-Ad

9、oMetDCas，Ad-ODCas和Ad-GFP分別以50MOI感染A-549細(xì)胞后，用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 【研究結(jié)果】 ①基因轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以50MOI的Ad-GFP感染肺癌細(xì)胞48h后，大約有75％肺癌A-549細(xì)胞GFP表達(dá)陽(yáng)性，但不會(huì)引起細(xì)胞毒性(圖1)。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)肺癌細(xì)胞A-549有劑量依賴(lài)性的抑制作用(圖2)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果挑選A-549細(xì)

10、胞的感染滴度為50MOI。正常情況下A-549細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)更趨低平(圖3)，最大生長(zhǎng)抑制率可達(dá)70％，而無(wú)明顯細(xì)胞毒性。 ③采用Western印跡法顯示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染肺癌A-549細(xì)胞，可明顯抑制肺癌細(xì)胞中ODC和AdoMetDC基因表達(dá)，基因抑制率大于60％(p<0.05)，ODC和AdoMetDC含量明顯減少。 ④HP

11、LC結(jié)果顯示，肺癌Ad-549細(xì)胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后，細(xì)胞內(nèi)三種多胺含量都明顯降低(p<0.05)。 ⑤TUNEL標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，Ad-ODC-Ad0MetDCas可引起肺癌A-549細(xì)胞明顯凋亡。 【研究結(jié)論】 本研究結(jié)果表明以O(shè)DC和AdoMctDC為靶標(biāo)的反義腺病毒載體可以降低肺癌細(xì)胞內(nèi)多胺含量，能減少ODC和AdoMetDC基因的表達(dá)，減少肺癌細(xì)胞中的多胺的含量從而了抑制肺癌細(xì)胞的