IL-17D在肺臟腫瘤免疫編輯中的作用小劑量全身輻射后T細胞免疫重建特點及肉桂的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：肺癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，臨床診斷發(fā)現(xiàn)時肺癌往往已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注腫瘤微環(huán)境在肺癌中的作用。2002年美國生物學(xué)家 Shreigber提出腫瘤免疫編輯（tumor immunoediting）學(xué)說，該理論認為腫瘤發(fā)展包括3個階段，即清除（elimination）、平衡（equilibrium）及逃逸（escape）。隨著免疫編輯的進展，腫瘤細胞不斷增值、惡化，同時伴隨抗腫瘤免疫的失勢，以及局部

2、組織結(jié)構(gòu)的破壞。而局部組織結(jié)構(gòu)的破壞（包括局域細胞因子及趨化因子分泌模式的改變）又影響淋巴細胞的局部招募及功能表型，從而加速了免疫失勢，進而促進腫瘤惡化，如此形成惡性循環(huán)。
　　組織基質(zhì)細胞是最早感知免疫編輯的細胞群體，其如何通過細胞因子及趨化因子影響免疫失勢研究較少，是我們關(guān)注的焦點。IL-17家族是感知粘膜組織破壞最為敏感的危險感受器（danger sensor），其家族成員中，關(guān)于IL-17D的研究很少，有研究指出其主要表達

3、于肺臟、骨骼肌，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-17D主要由CD45-細胞表達。在此基礎(chǔ)上，了解IL-17D在肺臟組織中的具體來源細胞，闡明其在肺癌局域微環(huán)境中的作用。并探討NK細胞、CD8+T細胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律，認識IL-17D缺失影響NK細胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機制。
　　研究目的：1.我們前期的研究發(fā)現(xiàn)肺臟中IL-17D主要由CD45-細胞表達。在此基礎(chǔ)上，在小鼠肺臟腫瘤生長過程中，針對肺臟幾種基質(zhì)細胞，

4、探討肺臟IL-17D的主要細胞來源和表達變化趨勢。
　　2.明確NK、CD8+T細胞肺臟遷移模式、表型特征和功能變化規(guī)律，認識IL-17D缺失影響NK細胞肺臟遷移、表型和功能的調(diào)節(jié)機制。
　　研究方法：1.建立B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、小腸癌小鼠模型；采用滴鼻吸入IL-17D制劑的方式給予小鼠外源性補充IL-17D。
　　2.實時定量熒光PCR技術(shù)檢測小鼠肺臟、皮膚、小腸組織的IL-17D表達；q-PCR技術(shù)檢測小鼠肺

5、臟趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、S1Pr5及細胞因子S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF、IL-22、IL-23、IL-1β、TNF-a的mRNA表達。
　　3.流式細胞胞內(nèi)外因子雙染法檢測小鼠肺臟成纖維細胞的IL-17D分泌水平；流式細胞術(shù)檢測小鼠肺臟CD4+T、CD8+T、NK細胞比例及其分泌IFN-γ水平。
　　4.采用膠原酶消化法及組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代小鼠肺成纖維細胞及人胚胎肺成纖維

6、細胞，并采用差時貼壁法進行純化，采用流式細胞術(shù)檢測表面標(biāo)志進行鑒定。
　　5.腫瘤細胞與肺成纖維細胞不同比例共培養(yǎng)，腫瘤培養(yǎng)上清與肺成纖維細胞不同濃度共培養(yǎng)，RT-PCR技術(shù)檢測肺成纖維細胞IL-17D、CXCL9、CXCL10的mRNA表達。
　　6.為進一步驗證IL-17D對肺臟成纖維細胞局域招募NK及CD8+T細胞的影響及機制，將肺成纖維細胞種于下室，采用肺癌細胞LLC細胞上清及IL-17D對肺成纖維細胞進行刺激，并將

7、其與外周血、肺臟、脾臟中的淋巴細胞采用Transwell共培養(yǎng)，采用流式細胞術(shù)檢測進入下室的淋巴細胞中NK及CD8+T細胞的比例。 RT-PCR技術(shù)檢測下室肺成纖維細胞IL-17D、CXCL10、IL-15的mRNA表達。
　　研究結(jié)果：1. IL-17D在腫瘤組織中表達下降。
　　q-PCR及流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，在肺臟中，IL-17D主要由CD45-細胞表達；IL-17D在B16轉(zhuǎn)移性肺癌、皮膚癌、腸癌組織中的蛋白及mR

8、NA表達均顯著下降（P<0.05），在肺癌組織中的降低尤為明顯。另外，在B16轉(zhuǎn)移性肺癌組織中，IL-17D的mRNA表達水平隨時間呈遞減趨勢。
　　2.肺臟中IL-17D的細胞來源。
　　流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，肺臟中CD45-IL-17D+的細胞中有40~80％是成纖維細胞（CD45-CD140a+）。另外，流式細胞胞內(nèi)外因子雙染法表明，肺臟成纖維細胞分泌的IL-17D在小鼠B16轉(zhuǎn)移性肺癌中顯著減少（P<0.05）。

9、>　　3. B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域浸潤淋巴細胞的表達模式。
　　流式結(jié)果顯示，B16轉(zhuǎn)移性肺癌局部浸潤的CD3+T、CD8+T及NK細胞比例均顯著降低（P<0.05），CD4+T無明顯變化；另外，NK細胞分泌的IFN-γ明顯減少（P<0.05），而CD4+T、CD8+T細胞分泌IFN-γ無顯著變化。
　　4. B16轉(zhuǎn)移性肺癌局域趨化因子及細胞因子分泌模式。
　　肺臟成纖維細胞可分泌CXCL9、CXCL10、GM-CSF

10、、IL-1β、TNFa和IL-23等多種因子，不但可以募集多種淋巴細胞的局部聚集，也影響原位淋巴細胞的表型和功能。
　　q-PCR結(jié)果顯示，與正常對照小鼠相比，B16轉(zhuǎn)移性肺癌小鼠肺臟CXCL9、CXCL10的mRNA表達水平顯著下降（P<0.05）；S1Pr1、IL-12、IL-15、GM-CSF的mRNA表達均明顯下調(diào)（P<0.05）。
　　5. IL-17D抑制小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。
　　與PBS對照組相比，IL-17

11、D滴鼻小鼠的肺臟腫瘤克隆數(shù)顯著下降（P<0.05），并且伴隨肺臟局部浸潤CD8+T及NK細胞比例顯著增加（P<0.05）；另外，q-PCR結(jié)果顯示，IL-17D滴鼻小鼠的肺臟CXCL9、CXCL10、GM-CSF的mRNA表達水平明顯上升（P<0.05），表明IL-17D可能是通過CXCL9、CXCL10趨化NK、CD8+T細胞至腫瘤局部，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　6.腫瘤細胞抑制原代肺成纖維細胞IL-17D表達。
　　B16腫

12、瘤細胞與小鼠肺成纖維細胞共培養(yǎng)后收集細胞做RT-PCR，結(jié)果顯示，B16細胞可明顯抑制成纖維細胞IL-17D及趨化因子CXCL9、CXCL10的mRNA表達，且抑制效果與共培養(yǎng)比例呈正相關(guān)。另外人肺癌A549細胞培養(yǎng)上清可顯著抑制原代人胚胎肺成纖維細胞的增殖及IL-17D及CXCL9、CXCL10的mRNA表達，且抑制效果呈濃度依賴性。
　　7. IL-17D對肺成纖維細胞體外趨化NK及CD8+T細胞的影響。
　　流式細胞術(shù)

13、顯示，與對照組（下層不接種細胞）相比，肺成纖維細胞可有效趨化肺臟、外周血及脾臟NK及CD8+T細胞進入下室。經(jīng)LLC上清刺激培養(yǎng)后，肺成纖維細胞對NK及CD8+T細胞的趨化作用顯著減弱（P<0.05），若同時加入r mIL-17D刺激，則肺成纖維細胞對NK及CD8+T細胞的趨化作用明顯增加（P<0.05），且與r mIL-17D劑量成正相關(guān)。
　　另外，通過收集下室肺成纖維細胞做RT-PCR，結(jié)果顯示，經(jīng)LLC上清刺激后，肺成纖維

14、細胞IL-17D、CXCL10及IL-15的mRNA表達水平顯著下調(diào)，若同時加入r mIL-17D刺激，則肺成纖維細胞IL-17D、CXCL10及IL-15的mRNA表達水平明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：1.肺臟成纖維細胞分泌的IL-17D在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用：肺癌中成纖維細胞分泌IL-17D減少可引起趨化因子CXCL9、CXCL10及細胞因子IL-12、IL-15、GM-CSF表達降低，進而導(dǎo)致腫瘤局域募集的NK、CD8+T細胞數(shù)

15、量減少、功能減弱，從而促進腫瘤肺轉(zhuǎn)移。
　　2.成纖維細胞分泌的IL-17D通過CXCL9、CXCL10趨化NK細胞及CD8+T細胞至腫瘤局部，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　研究背景：根據(jù)聯(lián)合國原子輻射影響問題科學(xué)委員會近期發(fā)表的一份報告指出，在全世界人口遭受的由自然或人為因素導(dǎo)致的各種輻射中，有接近20%來自醫(yī)療輻射。輻射（irradiation，IR）對放療病人及從業(yè)人員的損傷已引起社會廣泛關(guān)注，其通過產(chǎn)生反應(yīng)氧和自由基，可造成

16、機體活細胞尤其是免疫細胞形態(tài)與功能的損傷。臨床腫瘤放療產(chǎn)生的副作用，在免疫系統(tǒng)可表現(xiàn)為具有免疫抑制作用或促腫瘤作用的一些細胞亞群如Treg、Th17、MDSC等的累積。
　　T細胞是高度異質(zhì)性的細胞群體。其中，CD4+初始T細胞在不同細胞因子微環(huán)境下，可以向不同細胞亞群如Th1、Th2、Th17及Treg等分化，從而介導(dǎo)不同免疫功能。這些細胞亞群之間相互促進、相互抑制，共同打造機體有效的抗腫瘤免疫微環(huán)境，因此，輻射損傷后T細胞亞群

17、的免疫重建能力直接關(guān)系到機體的抗腫瘤作用。肉桂（cinnamon）具有滋養(yǎng)肝腎的作用，其作為香料和調(diào)味品在全世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。作為組方藥，肉桂常用于治療糖尿病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤等，而其在輻射后靶向T細胞的作用尚不明確。
　　研究目的：1.觀察小劑量全身輻射損傷后小鼠 T細胞亞群免疫重建的特點，為臨床如何利用機體自身的免疫修復(fù)能力科學(xué)選擇腫瘤放療頻率和時間提供實驗依據(jù)。
　　2.輻射損傷后免疫重建受損會削弱機體的抗腫瘤免疫，

18、本研究探討輻射后機體免疫重建受損對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及肉桂的調(diào)節(jié)作用，為臨床腫瘤放療病人藥物輔助治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
　　研究方法：1.肉桂水提液的制備：采用傳統(tǒng)法水煎、醇沉、回收乙醇，制備成肉桂水提液。
　　2.輻射損傷模型及肉桂制劑的干預(yù)方法：采用X射線2.5 Gy單次全身照射建立小鼠輻射損傷模型；在小鼠于飲用水中給予0.1%水提液建立肉桂處理模型。
　　3.腫瘤模型的建立：采用B16細胞2×105個尾靜脈注射，建立

19、轉(zhuǎn)移性肺癌模型。
　　4.采用血細胞分析儀檢測小鼠血常規(guī)變化。
　　5.流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血、脾臟中CD3+T、CD4+T、CD8+T變化以及脾臟中CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表達水平。
　　6.胞內(nèi)外染色法分析小鼠脾臟及肺臟中 CD4+ T細胞各亞群 Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、 Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)、 Th2(CD3+CD4+IL-4+)、 Th17(CD3+CD

20、4+IL-17A+)、Treg(CD4+CD25+foxp3+)及IFN-γ+IL-17A+Th17細胞的比例變化。
　　7.逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測小鼠脾臟中CD4+T細胞各亞群特征性核轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3的mRNA水平的變化；RT-PCR技術(shù)檢測IL-12、IL-15、IL-23的mRNA水平變化。
　　8.利用解剖顯微鏡觀察輻射前后及肉桂處理前后小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移克隆數(shù)變化。
　　研究

21、結(jié)果：1.淋巴細胞是應(yīng)對輻射最敏感的細胞群體。
　　在血常規(guī)的幾項指標(biāo)中，淋巴細胞比例在輻射后第3、5天顯著下降（P<0.05），在輻射后第5天開始恢復(fù)，在10天較第3天顯著增加（P<0.05），開始恢復(fù)。單核細胞、粒細胞、紅細胞、血紅蛋白無顯著變化。
　　2.輻射損傷后T細胞亞群變化特點。
　　脾臟和外周血中的CD3+T細胞在淋巴細胞中的比例在第3、5天顯著降低（P<0.05），在第10天開始恢復(fù)。CD3+T細胞的絕

22、對數(shù)也發(fā)生同步改變。CD4+T細胞比例在第5天降到最低，在第8天開始恢復(fù)。CD8+T細胞比例和絕對數(shù)在第3天降至最低，在第5天已開始恢復(fù)，CD4+T細胞的免疫重建較CD8+T細胞延遲。
　　另外，共刺激分子CD80、CD86及MHC-II水平及IL-12、IL-15、IL-23的mRNA表達在輻射后第5天顯著降低（P<0.05），在輻射后第10天明顯增加（P<0.05）。
　　3.輻射損傷后CD4+T細胞各亞群變化特點。

23、r>　　通過檢測脾臟中Tc1、Th1、Th2、Th17、Treg在T細胞中所占比例，進一步觀察了CD4+T細胞細胞因子分泌模式，結(jié)果顯示，在輻射后第10天，伴隨著CD4+T細胞總體水平的恢復(fù)，CD4+T細胞各亞群仍處于失衡狀態(tài)，表現(xiàn)為：與對照組相比，Tc1、Th1亞群比例和絕對數(shù)顯著下降（P<0.05），Th2、Th17、Treg亞群比例則明顯增加（P<0.05）。具有抗腫瘤作用的IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例顯著降低（P<0

24、.05）。
　　4.肉桂調(diào)節(jié)輻射損傷后T細胞亞群免疫重建作用。
　　與輻射模型組相比，肉桂處理小鼠的Th1、Tc1亞群比例及細胞數(shù)顯著上升（P<0.05）， Th17亞群比例明顯降低（P<0.05），Treg細胞比例及絕對數(shù)均顯著下降（P<0.05）， Th2亞群無明顯變化。IFNγ+IL-17A+Th17亞群比例明顯增加（P<0.05）。
　　5. CD4+T細胞各亞群的特征性核轉(zhuǎn)錄因子變化。
　　與對照組相比

25、，照射后第10天小鼠T-bet的mRNA表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）， GATA3、RORγT、Foxp3的mRNA表達水平則明顯上調(diào)（P<0.05）；與照射小鼠相比，肉桂處理小鼠T-bet的mRNA表達水平顯著增高（P<0.05），F(xiàn)oxp3的mRNA表達水平則明顯降低（P<0.05）， GATA3則無顯著變化。這些變化與CD4+T細胞各亞群變化一致。
　　6.肉桂加強了輻射損傷小鼠對抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
　　與B16小

26、鼠相比，輻射后B16小鼠肺部的腫瘤克隆數(shù)顯著增加（P<0.05）；與輻射后B16小鼠相比，肉桂處理的輻射后B16小鼠肺部腫瘤克隆數(shù)明顯降低（P<0.05）。
　　7.輻射損傷前后肺部腫瘤局域T細胞亞群變化特征。
　　與正常B16小鼠相比，輻射損傷后B16小鼠肺臟腫瘤浸潤Th1、Tc1比例顯著降低（P<0.05），肉桂處理后，Th1、Tc1比例顯著增加（P<0.05），這些變化也與腫瘤發(fā)展一致。
　　結(jié)論：
　　1