人TIMP2蛋白在肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲中的作用.pdf

1、目的：通過原核表達(dá)的方法獲取人TIMP-2蛋白，探討TIMP-2在肝癌遷移及侵襲中的作用。
　　方法：
　　（1）以肝癌SMMC-7721細(xì)胞總RNA為模板，用RT-PCR技術(shù)獲得目的基因，將目的基因克隆到載體pMD18-T上；酶切鑒定和測序后將TIMP-2編碼區(qū)導(dǎo)入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-TIMP-2，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株Origami(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，采用親和層析法純化

2、表達(dá)產(chǎn)物，用SDS-PAGE電泳檢測并用western blot驗(yàn)證。
　?。?）用RNAi技術(shù)和添加外源蛋白的方法分析TIMP-2蛋白對肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移和侵襲的影響；用siRNA-TIMP-2轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，采用熒光定量PCR及western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)源性TIMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pGEX-TIMP-2，并在原核

3、宿主Origami中大量表達(dá)，并獲得純化的融合蛋白GST-TIMP-2。
　?。?）與對照組相比，外源添加的TIMP-2蛋白抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移及侵襲能力(P＜0.05)；而siRNA-TIMP-2轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后，采用熒光定量PCR及western blot方法檢測顯示：TIMP-2 mRNA以及蛋白水平表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，與對照組相比，SMMC-7721細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)(P＜0.0