趨化因子CCL28在缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用研究.pdf

1、背景與目的:肝細(xì)胞肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國居惡性腫瘤死亡率第二位。轉(zhuǎn)移一直是影響肝癌預(yù)后的重要因素。肝癌細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力，與其所在的腫瘤微環(huán)境是密切相關(guān)的。缺氧是實體腫瘤發(fā)展過程中的常見現(xiàn)象之一。研究認(rèn)為缺氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、生成新生血管和促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化因子是一族分子量為8-14kDa大小的趨化作用的細(xì)胞因子，通過與其相應(yīng)受體結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化到炎癥部位的作用。近來不斷有研究證實

2、趨化因子及其受體在腫瘤的生長，侵襲，血管生成和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。已有研究報道CCL2和CCR2與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是其他趨化因子在腫瘤發(fā)展中的作用仍知之甚少。本研究著重于探索CCL28在缺氧誘導(dǎo)的人肝癌轉(zhuǎn)移過程中作用。
　　方法:應(yīng)用實時定量PCR檢測50例肝細(xì)胞癌組織中CCL28和HIF-1αmRNA表達(dá)情況并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，運用卡方檢驗，Kaplan-Meier分析HIF-1α及CCL28表達(dá)與年齡、性別、乙肝病毒標(biāo)記

3、物、肝硬化、分化、包膜、甲胎蛋白等臨床病例特征及患者總體生存時間的關(guān)系;同時在體外細(xì)胞實驗中，采用實時定量PCR，Western blot與酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測缺氧對肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3 HIF-1α和CCL28表達(dá)的影響;運用RNA干擾（siRNA）和Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)HIF-1α基因表達(dá)對肝細(xì)胞癌HCCLM3細(xì)胞CCL28蛋白表達(dá)的影響。通過抑制CCL28表達(dá)，結(jié)合Tran

4、swell和BDMatrigel觀察CCL28在缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲遷移中的作用;采用明膠酶譜法測定CCL28-siRNA干擾后細(xì)胞上清的金屬蛋白酶含量的差異。
　　結(jié)果:1）實時定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中HIF-1αmRNA含量0.0654±0.0988，29/50(58％)例呈高表達(dá)。CCL28mRNA水平在肝癌組織為0.0254±0.0755，23/50(46％)例呈高表達(dá)。Spearman雙變量相關(guān)性分析顯示肝細(xì)胞癌組織

5、中CCL28與HIF-1α mRNA水平呈高度相關(guān)(r=0.595，p＜0.001);二者表達(dá)水平增高皆與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　2)體外細(xì)胞實驗顯示肝癌HepG2和HCCLM3細(xì)胞HIF-1α和CCL28mRNA水平在缺氧(1％O2)培養(yǎng)6h后開始增加，二者的蛋白表達(dá)水平在缺氧培養(yǎng)12h后開始增高，并呈現(xiàn)出時間依賴性。利用HIF-1α特異性siRNA阻斷HIF-1α的表達(dá)后，CCL28蛋白的表達(dá)水平則隨著HIF-1α表達(dá)抑制而減少;

6、
　　3)利用siRNA抑制HCCLM3細(xì)胞內(nèi)CCL28表達(dá)，經(jīng)實時定量PCR和ELISA證實mRNA和蛋白水平明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)干擾HCCLM3細(xì)胞內(nèi)CCL28表達(dá)后，缺氧條件下遷移和穿膜細(xì)胞數(shù)目較空白組減少，細(xì)胞MMP-2的分泌也減少。
　　結(jié)論:1）HIF-1α和CCL28在肝癌組織中mRNA表達(dá)增高，且表達(dá)水平呈高度相關(guān)性。二者表達(dá)水平增高皆與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　2)缺氧可通過HIF-1α上調(diào)肝癌細(xì)胞CCL28