骨橋蛋白(OPN)在人卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲過程中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是女性常見的腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于子宮癌和子宮頸癌,而列居第三位.但因卵巢癌致死者,卻占各類婦科腫瘤的首位,嚴重威脅著女性生命健康.因此防治卵巢癌的研究正日益受到重視,而預(yù)防卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移則是抵抗卵巢癌行之有效的治療手段.
　　骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種多功能的胞外基質(zhì)蛋白,通過與細胞表面的整合素受體αvβ3及CD44受體結(jié)合,介導(dǎo)腫瘤細胞的粘附、侵襲及轉(zhuǎn)移.這樣,骨橋蛋白在癌癥發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

2、,就預(yù)示著OPN可能成為惡性腫瘤治療的一個新靶點,而阻斷OPN與其受體的信號傳導(dǎo)可能為腫瘤治療提供新的生物學(xué)依據(jù).
　　本研究針對OPN設(shè)計出三對siRNA,即人OPN mRNA255位點、483位點、831位點,并構(gòu)建表達載體pGPU6/GFP/Neo-shOPN,同時設(shè)置陰性對照pGPU6/GFP/Neo-shNC,運用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)入細胞中,通過熒光顯微鏡觀察瞬時轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率為60％.通過G418成功篩

3、選出7個陽性克隆株.利用ELISA進行檢測,發(fā)現(xiàn)OPN被沉默后表達下降,從而篩選出表達 OPN蛋白最低的單克隆細胞株,即pGPU6/GFP/Neo-OPN1-3(M1-3細胞),此單克隆細胞為255位點構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入的細胞.應(yīng)用細胞熒光免疫組化實驗檢測OPN的表達情況,結(jié)果顯示OPN被沉默后紅色熒光減弱,說明OPN表達下降,從而證實OPN基因沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功.
　　本論文通過細胞表型實驗:MTT細胞增殖活力分析、軟瓊

4、脂克隆形成實驗、創(chuàng)口愈合實驗、基質(zhì)膠侵襲實驗對7個陽性克隆株進行分析發(fā)現(xiàn):實驗組M1-3(pGPU6/GFP/Neo-OPN1-3)同對照組MC(HO-8910PM未處理組)相比,細胞增殖活力、克隆形成數(shù)量、轉(zhuǎn)移侵襲能力均明顯降低,且差異顯著.說明OPN被沉默后人卵巢癌細胞的增殖侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱.因此,成功篩選出M1-3(OPN被沉默的HO-8910PM)細胞進行后續(xù)實驗研究。
　　有證據(jù)顯示 TLRs表達于多種腫瘤細胞表面.通過

5、TLR4特異的激動劑細菌脂多糖LPS刺激腫瘤細胞,發(fā)現(xiàn)能促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲.然而骨橋蛋白OPN亦能增強腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,那么TLR4信號與OPN表達是否有某種聯(lián)系?
　　基于上述疑問,接著本研究通過使用TLR4特異的激動劑LPS刺激MC(HO-8910PM細胞)和M1-3(OPN被沉默的HO-8910PM細胞),通過MTT增殖活力實驗、創(chuàng)口愈合實驗、基質(zhì)膠侵襲實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)實驗組M1-3(OPN被敲低的HO-8910PM細胞

6、)同對照組MC(HO-8910PM細胞)相比,細胞增殖轉(zhuǎn)移及侵襲能力明顯降低,說明OPN被沉默后降低了人卵巢癌HO-8910PM細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力.(2)MC和M1-3細胞經(jīng)LPS處理6h后,與正常組(未加LPS處理組)相比,細胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力均表現(xiàn)出升高,且M1-3比MC細胞轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移侵襲能力增強的程度低,說明OPN沉默能影響LPS促使的人卵巢癌細胞HO-8910PM的轉(zhuǎn)移及侵襲.從而能證實LPS通過上調(diào)OPN的表達來促進HO-

7、8910PM細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲.
　　利用ELISA實驗和細胞熒光免疫組化實驗檢測LPS刺激OPN基因沉默人卵巢癌的OPN表達情況,實驗結(jié)果顯示:(1)M1-3(OPN被沉默的細胞)比MC(HO-8910PM) OPN表達明顯減少,且差異顯著.(2)MC和M1-3細胞經(jīng)LPS處理6h后,均比正常組(未用LPS處理)OPN表達升高,且M1-3(OPN被沉默的細胞)比MC細胞OPN表達升高的程度低.說明OPN沉默影響LPS促使的人卵巢癌