EZH2調(diào)控TIMP2促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的研究.pdf

1、目的：1.細(xì)胞水平研究上皮性卵巢癌細(xì)胞中果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因2（EZH2）是否調(diào)控組織金屬蛋白酶抑制物2（TIMP2）基因的表達(dá)。
　　2.體外研究EZH2是否通過(guò)調(diào)節(jié)TIMP2/基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）途徑影響卵巢癌的侵襲遷移能力。
　　材料和方法：1．在卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV3、ES2中利用慢病毒轉(zhuǎn)染沉默EZH2的短發(fā)夾RNA(shRNA)，篩選單克隆，建立EZH2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(shEZH

2、2)和相應(yīng)空載體細(xì)胞（shVector）。
　　2．應(yīng)用Western Blot檢測(cè)下調(diào)EZH2表達(dá)后H3K27me3、TIMP2及MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)，RT-PCR法測(cè)量EZH2和TIMP2mRNA水平，明膠酶譜查看MMP2、MMP9蛋白酶的活性是否發(fā)生改變。
　　3．在shEZH2細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)TIMP2的小干擾RNA(siRNA)降低TIMP2的表達(dá)。
　　4．劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shV

3、ector細(xì)胞、shEZH2細(xì)胞、瞬轉(zhuǎn)對(duì)照siRNA后的shEZH2細(xì)胞細(xì)胞（shEZH2+siNC）和瞬轉(zhuǎn)siTIMP2后的shEZH2細(xì)胞（shEZH2+siTIMP2）的遷移能力改變，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果：1.慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率可達(dá)90％以上，篩選單克隆后，A2780、SKOV3、ES2細(xì)胞中EZH2穩(wěn)定低表達(dá)，EZH2敲除效率分別為72％（P=0.001）、82％（P=0.004

4、）、82％（P=0.005），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.A2780、SKOV3細(xì)胞中，下調(diào)EZH2的表達(dá)后，TIMP2mRNA水平分別升高1.6倍、2.1倍（PA2780=0.001，PSkov3=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而TIMP2蛋白表達(dá)升高，MMP2、MMP9蛋白表達(dá)降低且MMP2、MMP9的酶活性降低。而在卵巢癌細(xì)胞ES2中，下調(diào)EZH2的表達(dá)后，TIMP2mRNA表達(dá)變化不大（1.1倍，P=0.01），而TIM

5、P2蛋白表達(dá)和MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)及酶活性也無(wú)顯著改變。
　　3.siRNA干擾shEZH2-A2780和shEZH2-SKOV3細(xì)胞后，RT-PCR提示TIMP2的敲除效率均可達(dá)99％以上，P值均<0.001，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.在A2780和SKOV3組細(xì)胞中，shEZH2細(xì)胞與shVector細(xì)胞相比最大遷移距離分別降低36.8％和31.2％（PA2780=0.004，PSkov3=0.011），遷移細(xì)

6、胞數(shù)分別減少84.9％和88.9％（PA2780=0.002，PSkov3=0.001），侵襲細(xì)胞數(shù)分別降低81.4％和75.5％（PA2780=0.002，PSkov3=0.001），提示降低EZH2的表達(dá)可使卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力降低；而shEZH2+siTIMP2與shEZH2+siNC細(xì)胞相比最大遷移距離分別升高2.2倍和1.9倍（PA2780=0.002，PSkov3=0.007），遷移細(xì)胞數(shù)分別升高3.9倍和5.8倍（PA2