兒童急性髓性白血病(AML)診斷相關(guān)miRNAs標(biāo)記物的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：研究表明，差異表達(dá)的miRNAs可以參與白血病的發(fā)生?；谏镄畔W(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果，我們檢測(cè)了幾種與兒童急性髓性白血病發(fā)生密切相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況，分析其在兒童AML診斷和預(yù)后中的意義，并探討其功能。
　　方法：我們前期使用生物信息學(xué)分析技術(shù)，篩選了與初診兒童急性髓性白血病最為密切相關(guān)的三種miRNAs；隨后，我們隨機(jī)抽取了83例初診AML患兒骨髓標(biāo)本，并以29例非惡性病兒童正常骨髓作為對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶鏈

2、反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè)這三種miRNAs的表達(dá)情況（以2-△△Ct表示），并結(jié)合臨床資料分析其意義；最后，進(jìn)一步探討其在細(xì)胞功能方面的影響以及可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.前期生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果：三種miRNAs（miR-196b,miR-155,miR-25）與兒童AML發(fā)生密切相關(guān)；IGFBP7基因是miR-196b的一個(gè)預(yù)測(cè)靶基因。
　　基于改良POMA軟件的生物信息學(xué)分析顯示，與初診兒童AML診

3、斷最為密切相關(guān)的三種miRNAs是miR-196b,miR-155和miR-25(Wilcoxon test,p<0.05;NOD=30,28和32,TFP=0.289,0.242和0.191).
　　2.臨床標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果：
　　miR-155在初診 AML患兒組顯著高于對(duì)照組（p<0.0001）；miR-196b在單核細(xì)胞系A(chǔ)ML（M4/5組）顯著高于對(duì)照組（p=0.032）和非單核細(xì)胞系A(chǔ)ML（非M4/5組）（p<0.0

4、001）。
　　3.三種miRNAs對(duì)預(yù)后的影響：
　　高水平的miR-196b,miR-155均與不良預(yù)后（整體生存率OS）相關(guān)（Log Rank p<0.0001,=0.011）；miR-25與AML患兒預(yù)后未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性(Log Rank p>0.05)。
　　綜合WHO2008推薦方法和NCCN2015AML指南進(jìn)行預(yù)后分組：miR-196b,miR-155在預(yù)后良好組表達(dá)最低（p<0.001,p=0.000

5、2）；在誘導(dǎo)緩解一療程評(píng)估中：miR-196b在未緩解組表達(dá)高于緩解組（p=0.018），miR-155,miR-25未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；在不同突變類(lèi)型間：miR-196b以FLT3-ITD組最高（p=0.037），miR-155，miR-25的表達(dá)水平以C-Kit組最高（p=0.004,0.047）；在不同染色體核型間亦有明顯差異：miR-196b表達(dá)水平以t(8;21)組最低（p=0.0002），11q23(MLL)組

6、最高（p=0.0002），miR-155表達(dá)水平以t(15;17)組最低（p=0.0004）。
　　4.與其它臨床資料的相關(guān)性：
　　在白細(xì)胞（WBC）分組和年齡分組比較中發(fā)現(xiàn)，miR-196b表達(dá)水平均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，WBC≥100?109/L組和年齡≤12月齡組均明顯高表達(dá)（p=0.004,0.029），且miR-196b表達(dá)水平與初診血小板計(jì)數(shù)呈顯著正相關(guān)（Spearman’s r=0.31，p=0.004），而mi

7、R-155和miR-25表達(dá)水平在三者中均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.miR-196b候選靶基因IGFBP7在初診兒童AML臨床樣本中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（p<0.0001），Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示，初診時(shí)IGFBP7表達(dá)高的AML患兒預(yù)后較好，整體生存率高于低表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.045）。
　　6.miR-196b對(duì)白血病細(xì)胞株MV4-11細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、抑制VP16誘導(dǎo)的凋亡的作用

8、，此外，還對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化具有抑制功能。
　　7.通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上調(diào)/下調(diào)miR-196b表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)，IGFBP7基因與miR-196b之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.初診兒童AML中miR-155，miR-196b較對(duì)照組差異高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)，有望成為輔助兒童AML的診斷和預(yù)后判斷的新型標(biāo)記物
　　2.外源性高表達(dá)miR-196b具有促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖、抑制凋亡和